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目的:利用气质联用的方法,探索以泊洛沙姆407配制的广藿香醇高分子混悬溶液,经口服灌胃给药后,在大鼠体内的药动学情况;对比幽门螺杆菌临床株与标准株在侵入细胞能力上的异同,阐明其侵入机制;探索广藿香醇抗细胞内幽门螺杆菌的作用及其机制,并对广藿香醇在抗幽门螺杆菌治疗中必须要面对的抗菌后效应、细菌耐药性及对肠道微生物影响这三个方面进行研究。方法:①广藿香醇药动学研究:建立气质联用分析血浆中广藿香醇浓度的方法,对方法的定量下限、提取回收率、精密度、准确度和专属性进行考察。SD大鼠口服灌胃给药泊洛沙姆407配制的广藿香醇高分子混悬液,于设定的不同时间点眼眶采血后,测定血浆中广藿香醇的浓度,绘制药-时曲线,计算药动学参数。②幽门螺杆菌侵入细胞作用及机制研究:采用庆大霉素清除法配合荧光法检测幽门螺杆菌标准株NCTC11637、NCTC26695、SS1和ICDC111001,以及幽门螺杆菌临床株Hp1868、Hp1869、Hp1870和Hp1872侵入细胞能力的异同。使用抑制剂Cytochalasin B、2-apb、SKF-96365、Nifedipine 和 GdCl3 探索幽门螺杆菌侵入机制;Western Blot法检测幽门螺杆菌孵育GES-1和MKN45细胞后,细胞骨架运动相关蛋白(ROCK1、ROCK2、MYPT1、P-MYPT1、MLC 和 P-MLC)的表达。③广藿香醇抗细胞内幽门螺杆菌研究:庆大霉素清除法配合荧光法检测广藿香醇抗GES-1和MKN45细胞内幽门螺杆菌的作用,并检测乳酸脱氢酶(LDH)活性。观察广藿香醇对MKN45细胞板状和丝状伪足生产的影响,及其对幽门螺杆菌所致细胞跨膜电阻降低的影响。原代分离小鼠胃上皮细胞,Fura-2染色胞浆钙离子,观察广藿香醇对幽门螺杆菌所致细胞内钙增加的影响。Vina分子对接预测广藿香醇与钙调素的结合作用,表面等离子共振法对结合结果进行验证,Western Blot法检测广藿香醇对幽门螺杆菌所致细胞骨架运动相关蛋白过表达的作用。mRFP-LC3-GFP双标自噬腺病毒转染GES-1胃上皮细胞,检测广藿香醇对幽门螺杆菌诱发细胞自噬的影响。在体实验,预给药广藿香醇和抗生素三联两周,随后灌胃幽门螺杆菌SS1菌株,检查广藿香醇抗幽门螺杆菌感染的作用。④广藿香醇抗幽门螺杆菌特性研究:采用菌落计数法探究广藿香醇,甲硝唑和克拉霉素的抗菌后效应。梯度诱导法对比幽门螺杆菌对广藿香醇,甲硝唑和克拉霉素产生耐药性的强弱。二代基因测序法检测广藿香醇与抗生素三联疗法对肠道微生物菌群的影响。结果:①药动学结果:建立了以柏木脑为内参的血浆广藿香醇分析方法,大鼠口服给药广藿香醇混悬溶液的最大血药浓度Cmax为162.257±47.615 mg/1,达峰时间Tmax为 0.133±0.038 h,半衰期 T1/2 为 0.864±0.156 h,药-时曲线下面积 AUC0→t为 50.237±11.305 mg/l·h,AUC0→∞为 60.001±11.418 mg/l·h;MRTo-t 为 60.001±11.418 h。②幽门螺杆菌侵入作用及机制:庆大霉素清除法及荧光法结果均提示,幽门螺杆菌NCTC11637菌株在12 h内,侵入细胞内的数量随时间的增加而增加。临床株Hp1868、Hp1869和Hp1870的侵入能力明显强于4株幽门螺杆菌标准株NCTC11637、NCTC26695、SS1和ICDC111001。2-apb、Nifedipine、GdC13、Y27632及M7可以抑制幽门螺杆菌NCTC11637的侵入,2-apb,SKF-96365,Y27632以及M7可以显著性抑制幽门螺杆菌Hp1869侵入,Cytochalasin B、2-apb、SKF-96365、Nifedipine和GdC13均可以抑制幽门螺杆菌Hp1870的侵入。幽门螺杆菌感染会上调GES-1细胞骨架运动相关蛋白ROCK1、ROCK2、P-MYPT1和P-MLC的表达,上调MKN45细胞骨架运动相关蛋白ROCK2、P-MYPT1和P-MLC的表达。③广藿香醇抗细胞内幽门螺杆菌作用和机制:广藿香醇预孵育可以降低GES-1内幽门螺杆菌NCTC11637和Hp1869的量,降低MKN45细胞内幽门螺杆菌NCTC11637的量,也可以减少幽门螺杆菌导致的细胞LDH释放。广藿香醇可以抑制MKN45细胞伪足形成,使细胞形态变得钝圆,同时,广藿香醇可以抗幽门螺杆菌所致的细胞跨膜电阻降低。幽门螺杆菌可以诱发小鼠原代胃上皮细胞胞浆内钙离子浓度上升,广藿香醇可以抑制这一过程。分子对接软件预测广藿香醇与钙调素蛋白结合的亲和力在-6至-7,表面等离子共振法证实广藿香醇与钙调素之间的亲和力KD值为7.444×10-6,广藿香醇还可以抑制幽门螺杆菌所致的GES-1细胞ROCK2、P-MYPT1和P-MLC过表达。6.3×107病毒滴度的mRFP-LC3-GFP双标自噬腺病毒可以高效的转染GES-1细胞;幽门螺杆菌可诱导的GES-1细胞产生自噬流,且自噬流较多停留在自噬小体,广藿香醇预孵育的GES-1细胞在接触幽门螺杆菌后,也会产生自噬流,但其自噬流多停留在自噬溶酶体。广藿香醇预给药小鼠两周,可以降低幽门螺杆菌感染的小鼠数量,体现出抗幽门螺杆菌感染的作用④广藿香醇抗菌后效应、耐药性和对肠道微生物的影响:广藿香醇、甲硝唑和克拉霉素均体现出一定的抗菌后效应,其中2倍最小抑菌浓度的甲硝唑和克拉霉素的抗菌后效应分别是6.3和12.4 h,1.5倍最小抑菌浓度的广藿香醇的抗菌后效应是7.5 h,2倍最小抑菌浓度的广藿香醇处理幽门螺杆菌2 h会使其完全失去再次生长的能力。梯度诱导法提示,幽门螺杆菌容易对甲硝唑产生耐药,而9代内对广藿香醇不产生耐药。二代测序法结果提示,抗生素三联灌胃两周后,肠道微生物的种类和数量都会明显下降,而灌胃广藿香醇不会对肠道菌群造成明显的破坏。结论:广藿香醇在大鼠体内的药物吸收和代谢速率很快,半衰期T1/2为0.864 h。多数临床株表现出更强的侵入细胞内的能力,由幽门螺杆菌诱发的胞浆钙离子浓度增加及细胞骨架重排是细菌侵入的必要条件。广藿香醇可以抑制幽门螺杆菌引起的细胞膜过度运动从而抗幽门螺杆菌侵入,也可以增强细胞消化侵入幽门螺杆菌的能力,表现出抗幽门螺杆菌感染作用。进一步的抗菌特性研究发现,广藿香醇在治疗幽门螺杆菌感染时表现出强大的抗菌后效应,且不易诱发细菌耐药,对肠道菌群影响小。