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目的:研究人β-防御素-3(hBD3)对肠上皮细胞自噬的调节作用及其分子机制,以及hBD3通过调节自噬对肠上皮细胞迁移及新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)大鼠模型的影响。方法:通过雷帕霉素(rapamycin)诱导肠上皮细胞系IEC-6和Caco2以建立细胞自噬模型,通过透射电子显微镜(TEM),蛋白印迹(western blotting)和免疫荧光技术检测hBD3对肠上皮细胞中m TOR自噬信号传导通路的影响。应用AMD3100(CXCR4抑制剂)和CXCR4si RNA处理从而验证CXCR4在上述过程中的作用。通过划痕实验和Transwell迁移实验阐明hBD3介导的自噬调控对肠上皮细胞迁移的影响,并通过ATG7 si RNA转染的肠上皮细胞进一步佐证hBD3通过调控自噬对肠上皮细胞迁移的影响。此外,通过沉淀实验检测Rho蛋白活化情况,并进一步评估其下游效应分子如肌球蛋白轻链2(MLC2)和F-actin的表达水平。通过配方喂养+缺氧冷刺激诱导新生Sprague-Dawley大鼠从而建立NEC大鼠模型。将新生大鼠随机分为4组:control+NS(n=11),control+rapamycin(n=11),NEC+NS(n=12)和NEC+hBD3(n=8)。对照组大鼠均为母乳喂养。各组大鼠在造模前1h分别经胃管注入雷帕霉素(5mg/kg/d),hBD3(100ug/kg/d)或相同剂量的生理盐水。在整个造模过程中详细记录各组大鼠的体重和存活时间。造模结束前18小时腹腔注射Brd U(50mg/kg)评估各组大鼠的肠上皮细胞的迁移情况。收集肠管组织和血清用于检测自噬相关基因和炎症因子的表达,并检测肠上皮细胞间紧密连接蛋白表达从而评估肠粘膜完整性。结果:50n M rapamycin刺激Caco2细胞24h、200n M rapamycin刺激IEC-6细胞24h可成功构建肠上皮细胞自噬模型,应用hBD3预处理可以促进AKT与m TOR的磷酸化从而抑制肠上皮细胞内rapamycin诱导的自噬(P<0.05),10μM AMD3100或CXCR4 si RNA(CXCR4si RNA沉默效率可达60%(P<0.05))预处理可有效抑制AKT与m TOR的磷酸化(P<0.05),逆转hBD3介导的肠上皮细胞自噬抑制过程。Rapamycin诱导的细胞自噬可显著抑制肠上皮细胞迁移速率(P<0.05),而hBD3预处理可明显促进肠上皮细胞迁移速率(P<0.05),转染ATG7 si RNA(ATG7 si RNA沉默效率可达60%(P<0.05))后再用hBD3预处理,肠上皮细胞迁移速率的差异无统计学意义。Rapamycin可抑制Rho蛋白活化、MLC2的磷酸化和F-actin的聚集,而hBD3预处理可在一定程度上逆转上述过程。与control+NS组相比,NEC+NS组新生大鼠体重和生存率明显降低(P<0.05),hBD3干预后体重和生存率增加且差异有统计学意义(P<0.05)。与NEC+NS组相比,NEC+hBD3组肠道损伤程度降低,平均NEC评分分别为1.33和2.52(P<0.05)。此外,在NEC+NS组,回肠和血清中炎性细胞因子IL-6、IL-10和TNF-α明显增加,但hBD3的干预可以相对下调其表达(P<0.05)从而减轻大鼠NEC模型的炎症损伤。自噬相关基因(Beclin1和LC3)在NEC+NS组中的表达显着增加,hBD3可显著降低自噬相关基因表达(P<0.05)。NEC+NS组肠上皮细胞迁移能力明显降低,hBD3能够促进肠上皮细胞迁移(P<0.05)。在NEC+NS组中观察到ZO-1和occludin表达下降,而hBD3可以在一定程度上增强紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达从而维持黏膜完整性。结论:hBD3与G蛋白偶联受体CXCR4结合,促进AKT磷酸化,激活m TOR激活,抑制肠上皮细胞自噬水平;hBD3介导的自噬抑制是hBD3促进肠上皮细胞迁移的可能机制之一,主要通过促进Rho蛋白活化、MLC2磷酸化和F-actin聚集实现;hBD3可显著降低NEC模型大鼠疾病严重程度,抑制过度激活的自噬,促进肠上皮细胞迁移,增强紧密连接蛋白表达,维持肠道粘膜屏障完整性。