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哺乳动物转录中介体复合物(Mediator Complex)是由进化上保守的大约30个亚基组成的多蛋白复合物,是RNA聚合酶Ⅱ转录装置中介于转录因子和RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)间传递信息的桥梁。当受到发育及环境的信号时,不同的转录因子就会结合Mediator中特定的亚基,招募PolⅡ和通用转录因子在基因的启动子上形成转录预起始复合物,从而起始下游基因的转录。 MED23也叫Sur2,最早在线虫中发现,是Mediator复合物尾部一个非常重要的亚基。最近几年的研究发现,MED23在基因转录、表观遗传学修饰、细胞分化以及肿瘤发生中扮演着非常重要的角色。我的工作主要集中于探究MED23与RNA潜在的的相互作用以及深入研究MED23如何调控Mitf基因的表达。 第一部分 MED23与RNA相互作用的探究 我们通过Phyre2对MED23进行结构预测,发现MED23的C末端二级结构与原核抗终止蛋白NusB具有高度相似性。而在原核生物转录过程中NusB可以和基因初始转录产物结合,这暗示MED23也可能与RNA存在相互作用。通过亲和层析实验和RIP实验我们初步判断MED23与RNA存在相互作用。我们进一步通过CRISPR/Cas9技术对MED23中可能与RNA相互作用的的氨基酸进行了点突变。我们试图通过研究MED23与RNA特别是LncRNA的相互作用来深入探索并理解MED23在转录起始延伸终止等阶段发挥的重要作用。 第二部分 MED23调控Mitf基因表达的机制研究 我们之前在黑色素瘤细胞B16F10中发现,Mitf是MED23调控色素合成和DNA修复过程的关键下游基因,敲低MED23会导致Mitf表达量下降。但是我们的研究也表明MED23既不影响调控Mitf上游转录因子的表达也不影响它们在Mitf基因启动子上的结合。增强子是一段可以激活靶基因转录的DNA序列,它的作用方式与方向位置无关。我们通过ChIP-seq分析预测出Mitf潜在的远端、近端和末端增强子,利用荧光素报告实验鉴定出这三个潜在增强子中只有远端增强子有活性并受MED23调控。利用CRISPR/Cas9技术删除远端增强子导致MITF蛋白表达下降,黑色素细胞变白。总之,我们的研究结果表明,MED23是通过控制远端增强子活性来调控Mitf基因表达的,这使我们可以更深刻地理解色素过程和皮肤疾病。