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为寻找南江黄羊快长品系标记辅助选择可用的分子标记,本研究将以405只南江黄羊为试验动物,以生长轴主要基因(GHRH、GH、GHR、IGF-Ⅰ和IGFBP3)为候选基因,利用PCR-SSCP技术和:DNA序列分析技术筛选其多态位点,并与南江黄羊的生长性状进行关联分析,以期筛选与南江黄羊生长性状相关的分子标记。本研究分五个部分进行:
(1)检测了GH基因外显子3、外显子4、外显子5和内含子2的多态,序列分析比对结果发现外显子3有2个SNPs(98 G/A;108 G/A),外显子4有个4 SNPs(27 G/A;68 C/A;136 G/A;170 C/T),外显子5有3个SNPs(36 C/T;187 C/T;202 C/T)和1个碱基插入(241 C插入),其中有5个SNPs引起了氨基酸替代:与南江黄羊生长性状的关联分析结果显示:外显子3的SNP多态与2月龄体重、周岁体重和体高、胸围性状存在显著相关(P<0.05),BB基因型是周岁体重、体高和胸围性状的有利基因型,其在发挥效应上表现为显性;外显子4的SNP多态与初生重、2月龄体重、6月龄体重和部分体尺指标显著相关(P<0.05):FF基因型是初生重、2月龄体重、6月龄体重、2月龄体长和2月龄胸围的有利基因型。其相关是来自于136位点(G/A)转换效应(同义突变)。外显子5多态与生长性状无关。
(2)克隆得到GHR基因的8个外显子,检测了10个外显子和5′调控区的多态,结果表明:在GHR基因5′调控区存在(G)<,10>、(G)<,11>与(G)<,14>多态和(TG)<,13>、(TG)<,14>与(TG)<,17>多态,关联分析结果显示该多态与2月龄体重、6月龄体重和周岁体重有关系,BD基因型个体的2月龄体重显著低于其他基因型(P<0.05);BD基因型和AC基因型个体的6月龄体重显著低于AA基因型、BB基因型和]CC基因型个体(P<0.05);DD基因型个体的周岁体重显著低于AA基因型、BB基因型和CC基因型个体(P<0.05)。基因效应剖分说明5′调控区多态对生长性状的影响主要来自于(G)<,n>多态,且(G)<,10>等位基因是生长性状的不利基因。GHR基因的10个外显子上未检测到多态。
(3)检测了IGF-Ⅰ基因4个外显子和5′调控区多态,结果表明:在外显子4的编码区外(内含子4)上存在G/C颠换多态,并与初生重和周岁体重有关系(P<0.05),CC基因型初生重显著高于GG基因型和CG基因型(P<0.05);CC基因型个体的周岁体重显著高于CG基因型(P<0.05),且对6月龄体长、6月龄体高、周岁体长和周岁体高的影响接近显著(P<0.1),在这四个体尺性状上,都表现为CC>GG>CG。初步认定CC基因型可能是初生重和周岁体重和周岁体尺的有利基因型。4个外显子与5′调控区未检测到多态。
(4)克隆得到南江黄羊GHRH基因部分片段(外显子2、内含子2和外显子3),并检测了该片段多态性,结果发现该片段不存在多态,6种生物(人、鼠、猪、奶牛、绵羊和山羊)该片段编码区序列同源性较高,保守性强。
(5)检测了IGFBP3外显子2、内含子2、外显子3和外显子4的多态,结果表明在这4个位点不存在多态。
GH基因外显子3、外显子4、GHR基因5′调控区和IGF-Ⅰ基因内含子4上的多态可能是与南江黄羊生长性状相关的分子标记,但还需要在南江黄羊群体和其他山羊品种中进一步的验证。