本课题组前期动物试验证明妊娠期及哺乳期BDE-209暴露可致仔鼠学习记忆能力障碍,但作用机制尚不清楚。本课题从细胞分子水平,用BDE-209对胎鼠海马神经元细胞进行染毒,光镜观察神经元细胞的形态与突触发育情况,通过测定凋亡、SOD活力、MDA及GSH含量氧化应激指标及神经发育相关蛋白,初步探讨BDE-209的神经毒性作用机制。本课题分为以下四个部分进行各项具体实验。 第一部分 BDE-209对原代胎鼠海马神经元细胞形态学的影响 [目的]：取孕龄19天胎鼠的海马组织进行原代神经元细胞培养,鉴别神经元的纯度,观察BDE-209对原代培养胎鼠海马神经元细胞形态结构及细胞存活牢的影响。 [材料与方法]: 1.购买孕龄19天wistar大鼠,取胎鼠海马组织进行原代神经元细胞培养。 2.培养7天后海马神经元细胞进行神经元细胞纯度鉴别。 3.原代培养7d的胎鼠海马神经元细胞暴露于BDE-209,实验共分6组,即对照组和实验A、B、C、D、E组(含BDE-209浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0和40.0ug/ml)。每组设3个平行样。对照组加入含1‰DMSO的培养液。24h后,在倒置显微镜下进行细胞形态观察。 4.MTT比色分析检测神经元的存活率。 [结果]: 1.原代海马神经元细胞培养第7天观察神经元胞体清晰明亮,呈明显凸起状,周围晕光明显,胞核及核仁清晰可见,突起变粗变长并有分支,边缘清晰,形成明显的神经网络。 2.免疫细胞化学法NeuN鉴定神经元的经典方法。由结果可见分散的海马神经元,神经元是主体,可占95％。 3.倒置显微镜观察不同剂量组神经元细胞形态,实验组可见神经元细胞胞体变小,变形,细胞膜完整但出现发泡现象,随着BDE-209浓度加大,发泡现象明显,其神经突起出现缩短。高剂量实验D、E组可见神经细胞膜不完整,皱缩,空泡明显,大量细胞出现皱缩、变圆、脱落,突起缩短甚至消失。 4.MTT比色分析检测神经元的存活率,高浓度BDE-209可明显降低海马神经元细胞存活率(P<0.01),随浓度增加细胞存活率有不同程度的下降,实验C、D、E组与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01)。 [结论]: BDE-209可以导致胎鼠海马神经元细胞及突触结构发生改变,随BDE-209浓度增加细胞存活率有不同程度的下降。 第二部分 BDE-209对原代培养海马神经元细胞凋亡的研究 [目的]:观察BDE-209对海马神经元细胞凋亡的影响。 [材料与方法]: 1.原代培养7天的胎鼠海马神经元细胞暴露于BDE-209,实验共分6组,即对照组和实验A、B、C、D、E组(含BDE-209浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0和40.0ug/ml)。每组设3个平行样。对照组加入含1‰DMSO的培养液。24h后进行检测。 2.采用流式细胞术检测海马神经细胞凋亡。 3.免疫细胞化学图像分析法检测海马神经细胞内Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax比值。 [结果]: 1.流式细胞术检测,对照组海马神经细胞凋亡率5.68％。不同浓度的BDE-209作用24 h后,均可致海马神经细胞出现凋亡。其中实验D、E组作用24 h后其凋亡率可高达64.86％和72.64％,表明BDE-209可导致海马神经细胞凋亡,与对照组相比差异均有显著意义(P<0.01)。 2.免疫细胞化学和图像分析显示海马神经细胞浆内Bax表达上调,BcL-2/Bax比值上调。 [结论]： BDE-209在一定剂量和作用时间内可致海马神经细胞的凋亡。可通过影响凋亡调控基因Bcl-2、Bax的表达,诱导海马神经元细胞调亡,这可能是导致仔鼠学习记忆能力下降的作用机制之一。 第三部分 BDE-209对原代培养胎鼠海马神经细胞中SOD、MDA及GSH的影响 [目的]：检测BDE-209对原代培养胎鼠海马神经元细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)含量的影响,探讨BDE-209对海马神经元细胞影响的作用机制。 [材料与方法]： 1.原代培养7d的胎鼠海马神经元细胞暴露于BDE-209,实验共分6组,即对照组和实验A、B、C、D、E组(含BDE-209浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0和40.0ug/ml)。每组设3个平行样。对照组加入含1‰DMSO的培养液。24h后进行检测。检测SOD活力、MDA及GSH含量。 2.采用黄嘌呤氧化法测定SOD活力。 3.采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。 4.采用Butler改良法测定GSH含量。 [结果]： 1.各染毒组SOD活力随染毒剂量增加而降低,实验组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。 2.各染毒组MDA含量随染毒剂量增加而增加,其中C、D、E组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。 3.各染毒组GSH含量随染毒剂量增加而减少,其中实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 [结论]： BDE-209暴露原代培养胎鼠海马神经元细胞可致氧化损伤,这可能是BDE-209神经毒性的作用机制之一。 第四部分 BDE-209对原代培养海马神经细胞中GAP-43及SYN1表达的研究 [目的]：了解BDE-209对海马神经细胞神经生长相关蛋白(GAP-43)及突触体素(SYN1)的表达变化。 [材料与方法]： 1.原代培养7天的胎鼠海马神经元细胞暴露于BDE-209,实验共分6组,即对照组和实验A、B、C、D、E组(含BDE-209浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0和40.0ug/ml)。每组设3个平行样。对照组加入含1‰DMSO的培养液。24h后进行检测。 2.收集细胞及蛋白的抽提。 3.免疫细胞化学的方法检测GAP-43及突触体素在海马神经元细胞中表达。 4.蛋白印记实验检测GAP-43及突触体素在海马神经元细胞中表达的量的变化。 [结果]： 1.SYN1在海马神经元细胞的表达：实验结果显示随染毒时间延长SYN1表达随之减弱。各实验组SYN1表达水平较对照组相比均有下降,差异有统计学意义(P<0.05)。 2.GAP.43在海马神经元细胞的表达：实验组与对照组比较均有下降,差异有统计学意义(P<0.05)。实验A与实验B、C组无明显差异。 [结论]： BDE-209在一定剂量和作用时间内可致海马神经细胞GAP-43及SYN1的表达下降。