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宿主健康与肠道菌群息息相关,一旦肠道菌群结构发生失调,各种相关联的疾病便随之发生。因此,获取肠道菌群的结构信息以及消长规律至关重要,特别是弄清晰与肠道健康密切相关的关键菌种(群)的变化,对阐述肠道疾病发生发展意义更加重要。众多的研究表明,高质量的基因组DNA是保障肠道菌群研究顺利开展的关键,也为进一步的分子生物学以及生物信息学的研究奠定了基础。益生菌制剂具有通过调节肠道菌群来改善机体健康的能力,是当今研究的热门领域。本研究首先以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和人体粪便为材料,采用球磨-十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)法探讨并确定获取细菌基因组DNA高得率和高质量的条件;随后应用实时荧光定量PCR技术,从肠道菌群变化着手,定量分析纯菌粉、水苏糖和MF13干预下腹泻、便秘和健康受试者肠道特定菌种(群)的变化规律,以便明确这些关键菌属对维护和改善肠道健康的科学价值。DNA提取结果显示,研磨珠直径为0.1mm条件下利用Mini-Bead Beater-16击打3.5分钟即可获得高质量粪便菌群DNA。本研究对16名志愿者肠道菌群中的双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌(Lactobacillus spp.)和普拉梭菌(Faecalibacteriurn prausnitzi)进行定量分析。纯菌粉干预腹泻人群肠道中乳杆菌量在短时间内大幅度增加,从干预前5.2±0.97到干预三周增长至6.36±0.40,普拉梭菌干预期间也一直处于持续增长水平,由干预前11.32±1.61到干预三周增至13.51±1.26,双歧杆菌、拟杆菌只有小幅度的变化;健康组肠道内普拉梭菌的量呈下降趋势,干预前为12.99±0.75至干预停止降为8.19±1.65,双歧杆菌、乳杆菌和拟杆菌无明显变化。水苏糖干预下,腹泻和便秘组中双歧杆菌、乳杆菌量随干预时间延长一直呈增长趋势,不断向健康组水平靠近,拟杆菌在三组受试者中都无明显变化,还发现水苏糖对腹泻受试者肠道内普拉梭菌有促进作用,干预前为11.33±0.89到干预停止增长至13±0.65,却抑制便秘和健康受试者肠道内普拉梭菌的生长。MF13干预下,腹泻和便秘组中乳杆菌、双歧杆菌和普拉梭菌的量都随干预时间增加呈持续增长趋势,腹泻组的拟杆菌量却由干预前的15.9±0.15到干预第五周降低至14.55±0.68,便秘组与其相反呈增长趋势,由干预前14.69±0.41到第五周增长至15.12±0.48,但干预终止后腹泻和便秘组拟杆菌、乳杆菌和普拉梭菌的量均接近健康水平;三个受试组人群肠道内双歧杆菌都有明显增长,健康组肠道内乳杆菌、拟杆菌和普拉梭菌在MF13的干预下明显低于干预前水平。比较TaqMan探针法和SYBR GreenⅠ染料法两种实时荧光定量PCR方法,结果显示两种方法下定量各菌群(种)变化趋势基本一致,其中TaqMan探针法qPCR定量普拉梭菌和拟杆菌结果大于SYBR GreenⅠ染料法qPCR定量数据,乳杆菌的定量结果与之相反,而两种方法定量双歧杆菌结果差异不大。普拉梭菌和拟杆菌量的拷贝数对数值基本都在8以上,乳杆菌的拷贝数对数值基本都低于8,而双歧杆菌拷贝数对数值处于8左右,说明TaqMan探针法qPCR检测灵敏度更高,SYBR GreenⅠ染料法qPCR在待测目标含量较低时产生假阳性结果。综上所述,三种益生菌制剂均能对肠道菌群产生影响,促进一些有益菌的生长。服用益生菌和益生元,能在一定程度上促进疾病人群有益菌的繁殖,但须长期干预,有依赖性;MF13的干预能促进腹泻和便秘人群肠道内双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌和普拉梭菌的量恢复到健康水平,健康人群长期服用MF13会对一些有益菌产生一定的拮抗作用。总之,通过几种肠道关键菌种(群)的定量分析,证实了益生菌制剂干预后具有较明显地改善腹泻和便秘人群肠道关键菌种(群)的作用;而在干预期内益生菌制剂对健康人群肠道关键菌种(群)的影响不显著。