干细胞生物学是目前科学领域中最具挑战和争议性的研究之一。近些年，由于这一研究的复杂性已使对其的研究态度发生了巨大改变。这种复杂性体现在假设和研究方法的多样性，如利用各种细胞系，实验室动物和人类组织标本等方法进行研究。而对癌症干细胞（Cancer stem cells，CSCs）这一类肿瘤起始细胞的研究则更为热烈。CSCs被定义为具有干细胞样特性和较强肿瘤发生能力的癌细胞的一个亚群。由于这些细胞抵抗传统标准放化疗，所以在癌症治疗中有重大影响力，而且对肿瘤治疗后的复发也存在不可忽略的作用。这些细胞的发现让我们对肿瘤复发，药物抵抗和癌症转移有了新的认识，并且为我们研究癌细胞从休眠转为恶性状态的能力开启了新的研究方向。因此，目前人类正尽力研究以期阐明CSCs的病理和分子特性，进而建立有效的抗CSC靶向治疗方法。对于杀死CSCs的新的治疗方法的体内研究进展中，最主要的是选择合理的动物模型，物种，品系和次代品系，重要的移植肿瘤研究技术和监测肿瘤的方法等。另外，识别并确认有可能成为治疗的有效靶点的不同的CSC标志物，这是我们面临的一个重大挑战。　　前列腺癌是一种男性常见的癌症类型，其主要危险因素为年龄，种族和家族史等。前列腺癌的早期通常无明显临床症状。但随着癌症进展，它会引起尿频尿急，排尿困难，血尿，疼痛和排尿烧灼感等，这些症状通常是在体检时发现的。前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）的检测水平和组织活检用于诊断前列腺癌。前列腺癌成分混杂，呈现多种细胞形态和组织病理学表现，而且具有显著的肿瘤组织学和免疫表型的异质性。低级别前列腺癌通常出现较差分化的区域，而高级别肿瘤则包含相对分化较好的病灶。这种前列腺癌组织的细胞基础和细胞异质性仍有待进一步研究。雄激素和雄激素受体（androgen receptor，AR）信号通路参与前列腺癌的发生发展。雄激素阻断治疗（Androgen-deprivation therapy，ADT）是通过阻断雄激素的产生或者AR通路来治疗前列腺癌的方法，并且是目前主要的治疗方法，但是这种方法只能维持短期有效性直至患者出现去势抵抗性前列腺（castration-resistant prostate cancer, CRPC）。而目前对于CRPC的细胞起源和分子特性的研究机制仍存在很多未知领域。　　Nanog，Oct4，Sox2和Klf4被认为是存在于胚胎干细胞核心多能性转化网络，且用于维持胚胎干细胞特性的一类基因。在这类基因中，Nanog则在多能细胞分化，尤其是在体细胞建立多能性基态过程中发挥着重要作用。相关文献已报道NANOG共存在11个同源基因，其中NANOG1，NANOG2和NANOGP8这3个基因可以编码成完整的蛋白质，其他8个同源基因则不能编码成完整的蛋白质。Nanog1是NANOG家族中较早发现的一个基因，是一个在人胚胎干细胞中高表达，对胚胎干细胞的自我更新及多能性不可或缺的同源转录因子。NanogP8是Nanog1的同源转座子，主要表达在体癌细胞。已经有一系列的研究显示由短发卡RNA（short-hair RNA，shRNA）调节的在前列腺，乳腺和大肠肿瘤细胞中剔除NanogP8会显著抑制肿瘤再生，而且，在体癌细胞中诱导性的过表达NanogP8会促进癌症干细胞的表型及特性。目前一个关键的尚未解决的问题是如果在体内组织特异性表达NanogP8是否可以促进肿瘤的发生发展。于是，我们创建了一个NanogP8的转基因小鼠模型。在这个小鼠模型中，ARR2PB作为启动子用来驱动来源于一个原发性前列腺癌病人的NanogP8 cDNA使NanogP8直接特异性表达于小鼠的前列腺组织。利用此模型为基础，我们对过表达NanogP8在正常生长发育的转基因小鼠中，在雄激素非依赖环境下的转基因小鼠中，以及Hi-Myc肿瘤小鼠中研究NanogP8对肿瘤发生发展的作用。　　本研究包含以下三个部分：　　第一部分、ARR2PB-NanogP8转基因小鼠模型的建立及过表达NanogP8对小鼠前列腺生长发育的影响　　方法：　　1.采用显微注射法将提纯后的目的基因DNA导入雌鼠胚胎中，并在小鼠出生10天后取其尾部组织利用普通PCR鉴定小鼠基因型。　　2.采用小鼠交配确定可以保留传代的转基因小鼠品系。　　3.采用HE染色法对转基因小鼠前列腺进行组织学分析。　　4.采用免疫组织化学染色方法确定目的蛋白的表达强度，并进行对比分析。　　5.采用Western Blotting对转基因小鼠器官组织中目的蛋白的表达进行验证。　　结果：　　1.利用从小鼠尾巴提取的DNA进行PCR检测，结果显示总共获得5个品系（Founder），通过交配传代后，经PCR验证只有Tg2和Tg4这两个品系可以保留传代。　　2.经过长达2年对Tg2（n>60），Tg4（n>40）和WT（n>40）小鼠的观察结果得出：三种小鼠外观未见明显异常，生长发育基本同步，寿命长短基本一致。Tg2和Tg4这两个品系的转基因小鼠并无自发性肿瘤生长。　　3.抗Nanog抗体免疫组织化学染色结果显示，Tg2小鼠前列腺组织Nanog细胞核染色为强阳性，Tg4小鼠为弱阳性，WT小鼠前列腺组织未见阳性Nanog细胞核染色，为阴性。Nanog主要定位于小鼠前列腺组织的管腔细胞并且在小鼠前列腺各叶的表达强度不同由强到弱依次为腹侧前列腺（Ventral prostate，VP），旁侧前列腺（Lateral Prostate，LP），背侧前列腺（Dorsal Prostate，DP）和前侧前列腺（anterior prostate，AP）。　　4.同年龄组Tg2和WT小鼠前列腺外观，大小及生长发育程度均未见明显差异；两种小鼠前列腺组织HE染色无明显差异，均未见明显病理性改变；Tg2与WT小鼠各器官HE染色对比均未见明显差别。　　5.Western-Blotting结果显示Tg2小鼠前列腺组织提取的蛋白在~42kD处出现阳性条带，而Tg2小鼠的其他组织器官（皮肤，舌头，心脏，肺脏，胸腺，肝脏，肾脏，食管，胃，小肠，大肠，睾丸及精囊腺）在~42kD处未见明显条带。　　第二部分、小鼠前列腺去势-再生模型的建立及在激素非依赖环境下过表达NanogP8对小鼠前列腺生长发育的影响　　方法：　　1.利用手术及药物方式对实验小鼠进行去势-再生模型建立。　　2.通过解剖小鼠前列腺验证去势小鼠前列腺是否萎缩，雄激素替代后小鼠前列腺是否恢复正常。　　3.采用HE染色分析去势-再生小鼠模型中小鼠前列腺的组织学变化，并进行对比。　　4.采用IHC染色对Tg2和WT小鼠前列腺组织切片中Nanog表达进行分析。　　结果：　　1.经过去势-再生（Castration-Regeneration）过程中对Tg2（n=21）和WT（n=20）小鼠的观察结果得出：两种小鼠外观未见明显异常，生长发育基本同步，Tg2转基因小鼠观察期内并无自发性肿瘤生长。　　2.去势手术8周后两种小鼠前列腺组织明显萎缩，两种小鼠前列腺大小及生长发育程度均未见明显差异；HE染色显示去势手术后两种小鼠前列腺组织细胞明显萎缩，并有部分纤维化发生；IHC染色结果显示Tg2小鼠前列腺组织几乎未见Nanog细胞核染色阳性，WT小鼠前列腺组织未见阳性Nanog细胞核染色，为阴性。　　3.再生实验后Tg2和WT小鼠前列腺组织明显恢复，甚至较正常前列腺组织更大，两种小鼠前列腺大小及生长发育程度均未见明显差异；HE染色显示前列腺组织细胞恢复正常，未见明显病理改变；IHC染色结果显示Nanog染色与未进行去势手术的转基因小鼠前列腺染色结果一致。　　第三部分、ARR2PB-NanogP8/ARR2PB-Myc双转基因小鼠模型的建立及过表达NanogP8对ARR2PB-Hi-Myc小鼠前列腺肿瘤发生发展的影响　　方法：　　1.将确定基因型的Tg2小鼠和Hi-Myc小鼠交配，对其后代应用普通PCR进行基因型鉴定。　　2.通过解剖小鼠前列腺验证PIN及腺癌形成，并对比Tg2-Hi-Myc和Hi-Myc小鼠前列腺外观及生长发育状况。　　3.采用HE染色分析转基因小鼠前列腺组织学改变并进行对比。　　4.采用免疫组化染色分析转基因小鼠前列腺组织Nanog和Myc细胞核染色并进行对比。　　5.采用免疫荧光染色分析小鼠前列腺组织Nanog，Myc和Ki67细胞核染色并进行对比。　　结果：　　1.Tg2小鼠(n>20)，Tg2-Hi-Myc小鼠(n>30)和Hi-Myc小鼠(n>20)，观察期>1年，Tg2-Hi-Myc小鼠与同年龄 Hi-Myc小鼠对比未见明显异常，可以正常繁殖生育，无明显异常可见表型，生长发育基本同步，生命周期长短未见明显差异。　　2.Tg2-Hi-Myc和Hi-Myc小鼠前列腺相比，LPs，DPs和APs的总体表型大致一样，可以观察到前列腺的PIN，在大多数（>80％）Tg2-Hi-Myc小鼠的VPs可见白点，而在Hi-Myc小鼠VPs并未见到；HE染色显示Tg2-Hi-Myc和Hi-Myc小鼠前列腺前列腺管腔均出现多处PINs和腺癌；与Hi-Myc小鼠相比，Tg2-Hi-Myc小鼠VPs的管腔包含更多的非典型性细胞；　　IHC染色结果：Tg2-Hi-Myc小鼠前列腺组织Nanog和Myc细胞核染色均为阳性，Hi-Myc小鼠前列腺组织Myc细胞核染色阳性，未见阳性Nanog细胞核染色。　　3.免疫荧光染色显示Tg2-Hi-Myc小鼠前列腺VPs与Hi-Myc小鼠前列腺VPs对比具有较多的分支/小管，管腔非典型性细胞层数较Hi-Myc小鼠多；细胞计数：Tg2-Hi-Myc小鼠前列腺VPs细胞数较Hi-Myc小鼠前列腺VPs细胞数明显增多（p<0.01）；Ki67染色显示，Tg2-Hi-Myc小鼠前列腺VPs Ki67染色阳性细胞数较Hi-Myc小鼠前列腺VPs明显增多（p<0.01）。　　结论　　1.前列腺组织特异性表达NanogP8的转基因小鼠模型成功建立。　　2.Nanog蛋白在转基因小鼠前列腺各部分表达有差异，表达量由高到低依次为VP，LP，DP，AP；在长达两年的观察期中未见NanogP8转基因小鼠有自发性肿瘤形成趋势。　　3.通过对Tg2和WT小鼠进行去势手术并注射雄激素受体阻断剂比卡鲁胺后，小鼠前列腺组织明显萎缩，Tg2小鼠前列腺未见明显Nanog染色阳性细胞；经激素替代后，Tg2和WT小鼠前列腺恢复正常形态及大小，未见明显病理改变。　　4.在整个Tg2小鼠前列腺去势-再生状态过程中NanogP8在小鼠前列腺管腔细胞中的过表达并不能引起肿瘤生长，也未见自发性肿瘤形成趋势。　　5.成功建立前列腺组织特异性Tg2-Hi-Myc双转基因小鼠。　　6.Tg2-Hi-Myc和Hi-Myc小鼠前列腺组织染色实验显示NanogP8前列腺特异性过表达在Hi-Myc小鼠模型中对肿瘤的发生有增强作用，并且可能促进肿瘤的转移。