研究背景目前临床上急需一种起效快、效果好、副作用小且能维持手术时间的新型皮肤外用局麻药物,用以满足皮肤穿刺性检查、皮肤外科手术以及激光美容等各种医疗手段所引起的皮肤浅表创伤性疼痛的镇痛需要。目前已有的透皮局麻药物如EMLA乳膏、或者酊剂、凝胶和霜剂等由于副作用明显或经皮渗透效果不理想等原因而达不到安全、有效的局麻目的。纳米乳（Nanoemulsion NE）具有制备简单、热力学稳定、增溶显著、抗菌等优点及独特的透皮特性,从90年代开始成为透皮传递给药系统（TDDS）研究中的热点。影响纳米乳透皮给药的最主要原因是纳米乳组方中的组份,尤其是其中的表面活性剂成份易对皮肤产生刺激性,而相关研究表明表面活性剂与纳米乳透皮性之间密切相关。因此,选择合理组份,如选择皮肤刺激性较低的非离子表面活性剂和其它组份按一定比例构成纳米乳组方,并对该组方的纳米乳进行较为系统的透皮机制研究,如研究纳米乳中哪种或哪些组份对纳米乳的透皮起主要作用、该组份的透皮作用机制、该组方构成的纳米乳在活体皮肤中的作用规律及透皮性与皮肤刺激性之间关系的综合评价等,则对以该组方为基纯⑾嘤Φ哪擅兹橥钙じ┲萍辆哂谢≈傅夹砸庖濉６壳坝泄啬擅兹橥钙せ频难芯烤銮阆蛴诒冉夏擅兹橛肫渌列图渫钙ば缘母叩?而对纳米乳的透皮机制、组方中对透皮起主要作用的组份及其刺激性之间的关系则缺乏相关研究。对已确定组方纳米乳的透皮作用机制展开系统研究的基础上,选择具有扩散性强、作用时间长、安全范围较大且刺激性较小等优点的利多卡因麻醉药,采用降低表面活性剂含量的制备工艺,并对相应组方纳米乳的稳定性、质量控制、透皮性、皮肤刺激性、透皮机制等进行综合研究分析,则非常有望研制出具有起效快,皮肤刺激性小、无致敏且局麻效果好等特点的新型透皮局麻药物。目的确定纳米乳组方中的组份,优化空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳的制备工艺,并对所制备的各种纳米乳的理化性质进行分析;研究空白纳米乳对皮肤超微结构的影响及产生影响的主要作用因素,并分析该影响与纳米乳透皮机制之间的关系;活体动物皮肤考察该组方纳米乳的透皮作用特点,包括透皮性高低、透皮路径及在皮肤中的动态分布规律;对制备的利多卡因纳米乳的质量进行控制研究和稳定性分析;比较分析利多卡因纳米乳与其它制剂的体外透皮性高低;通过细胞学实验和活体动物皮肤试验两方面对利多卡因纳米乳的皮肤刺激性进行评价,并分析利多卡因纳米乳中产生刺激性的主要因素;对利多卡因纳米乳的药效学进行初步比较研究。方法一、空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳组方的确定及理化性质考察。确定纳米乳组方中的组份,采用伪三元相图法结合origin7.0软件分析确定制备空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳的各自最佳Km值（表面活性剂/助表面活性剂比值）及组份的比例构成;马尔文Zeta粒径分析仪测定纳米乳的粒径大小、粒径分布范围和Zeta电位;透射电镜对纳米乳的电镜形态进行观察;采用染色法对纳米乳的体系类型进行判定。二、空白纳米乳的透皮机制研究小鼠随机分为空白纳米乳、阴性对照和空白皮肤对照组。分别取各组涂药2h和6h后的小鼠腹部皮肤进行固定,依次经70-100%的梯度乙醇脱水,一部分皮肤经二氧化碳干燥后表面喷胶体金颗粒进行扫描电镜观察,另一部分皮肤通过丙酮置换经环氧树脂包埋后经超薄切片和醋酸铀-枸橼酸铅双染后进行透射电镜观察。比较各组在2、6小时的皮肤角质层结构变化,Image Pro 5.0图像分析系统计算并比较各种制剂对棘细胞间间距的影响。三、纳米乳经活体动物透皮渗透的可视化定量分析研究雄性Wistar大鼠随机分为含有相同荧光素OB浓度的纳米乳、酊剂、IPM、Labrasol/Plurol Oleique溶液组,同时设立纳米乳和酊剂组的空白对照。分别于取标本前0.5,2h单剂量涂药,取皮并进行冰冻切片,切片皮肤包括表皮、真皮浅层、真皮深层和皮肤附属器（包括毛囊、汗腺、皮脂腺）,将切片进行CLSM扫描分析。通过CLSM内置软件对各制剂在不同透皮时间皮肤中各部位的荧光进行可视化定位分析并采集荧光,Image Pro 5.0软件对各组制剂在皮肤中各部位的荧光强度进行定量分析并比较。四、利多卡因纳米乳的质量控制分析及稳定性研究确定利多卡因纳米乳中利多卡因的高效液相色谱（HPLC）分析的条件和方法,通过HPLC法对利多卡因纳米乳进行质量控制研究,同时,对利多卡因纳米乳的光照、温度、空气暴露、加速试验等稳定性指标进行分析研究。五、利多卡因纳米乳的体外透皮渗透实验研究采用改良Franz扩散池,离体大鼠皮肤为透皮模型,HPLC法测定接受液中利多卡因的含量,比较5%利多卡因纳米乳、5%利多卡因凝胶和5%利多卡因酊剂体外透皮的累积透皮吸收量Q和皮肤滲透速率,并分析利多卡因纳米乳的体外透皮渗透类型。六、利多卡因纳米乳的皮肤刺激性实验研究（一）MTT法分析利多卡因纳米乳对人永生化上皮细胞Hacat细胞的刺激性,计算利多卡因纳米乳及其主要组份的半数抑制率IC₅₀值的大小,并对利多卡因纳米乳中刺激性产生的主要组份因素进行分析研究。（二）采用家兔皮肤刺激性试验（FHSA）,评价利多卡因纳米乳对动物活体完整皮肤和破损皮肤的外用刺激性大小。（三）采用组织病理学的方法研究利多卡因纳米乳对动物完整皮肤和破损皮肤的组织学改变。七、利多卡因纳米乳药效学的初步实验研究采用豚鼠背部皮肤浸润法对利多卡因纳米乳的皮肤局麻药效进行初步评价,并与EMLA乳膏进行比较研究。结果一、确定空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳的组方,并对其理化性质进行测定分析。通过伪三元相图法确定制备空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳的最佳Km值均为3,空白纳米乳IPM:水:（S/C）的组成比例为14%:36%:50%,荧光素OB-纳米乳OB-IPM:水:（S/C）的组成比例伪13%:40%:47%,利多卡因纳米乳中利多卡因IPM混合液:水:（S/C）为15%:40%:45%,利多卡因的含量确定为5%。三种纳米乳的平均粒径分别为28.8,65.4和29.8nm,电位依次为1.9,2.6和3.2mv。电镜形态均为球形且大小不等的多分散体系。染色法显示三者为均为水包油（O/W）型纳米乳。二、空白纳米乳的透皮机制研究扫描电镜分析结果显示与生理盐水对照组相比,纳米乳作用于皮肤使角质层表面粗糙不平,失去原有紧密的屏障结构,角质细胞间间隙增宽,并出现明显的角质细胞剥脱现象。透射电镜分析结果显示纳米乳和生理盐水透皮6h时,皮肤棘细胞间间距分别为2.69±0.08μm和1.21±0.09μm,纳米乳较生理盐水显著扩张了皮肤棘细胞间的间距（F=2278.400,P=0.000）,且纳米乳组小鼠的皮肤角质层显著变薄,其疏松游离程度更加明显,部分棘细胞间间丝出现断裂。三、纳米乳经活体动物透皮渗透的可视化定量分析研究纳米乳和酊剂透皮0.5h后,酊剂和纳米乳在表皮（F=2273.95,P=0.000）、真皮浅层（F=157092.5,P=0.000）、真皮深层（F=417890.3,P=0.000）中的荧光值均存在显著性差异,而皮肤附属器中荧光值的差异却并不显著（F=0.394,P=0.539）。透皮2h后,酊剂、纳米乳、IPM和Labrasol/Plurol Oleique溶液四种物质在表皮（F=9095.790,P=0.000）、真皮浅层（F=5058.656,P=0.000）、真皮深层中（F=11040.87,P=0.000）的荧光强度均存在显著性差异,而荧光强度在皮肤附属器中却无显著性差异（F=0.337,P=0.799）,四种物质在0.5h和2h时皮肤附属器中的荧光强度也无显著性差异（F=1.046,P=0.402）,表明纳米乳透皮性的高低不单是组方中的一种或多种成份决定,而是由各种成份共同构成的纳米乳体系所决定。结果显示纳米乳的透皮性高于常用的药物透皮制剂—酊剂,皮肤中毛囊、皮脂腺和汗腺等附属器对药物的透皮起一定作用,纳米乳和Labrasol/Plurol Oleique混合液作用于皮肤后,皮肤角质层要薄于正常皮肤。四、利多卡因纳米乳的质量控制分析及稳定性研究所采用的色谱条件能满足纳米乳中利多卡因HPLC分析的要求,检测方法专属性好,测得利多卡因纳米乳中的利多卡因含量为49.87±0.45μg·mL^-1。利多卡因纳米乳的时间稳定性较好,而在光照、温度过高（＞60℃）和过低（＜4℃）时的稳定性则不理想,提示利多卡因纳米乳应在避光、常温下保存。五、利多卡因纳米乳的体外透皮渗透实验研究5%利多卡因纳米乳、凝胶、酊剂的累计透皮吸收量具有显著性差异（F=11742.52,P=0.000）,纳米乳＞凝胶＞酊剂。纳米乳、凝胶和酊剂的皮肤渗透速率分别为155.64±7.48,63.29±4.20和48.58±3.13μg·cm^-2·h^-1,纳米乳的皮肤渗透速率分别是凝胶和酊剂的2.46和3.20倍,纳米乳透皮渗透符合零级释放动力学过程。六、利多卡因纳米乳的皮肤刺激性实验研究（一）利多卡因纳米乳和对Hacat细胞的抑制率与十二烷基硫酸钠（SDS）无显著性差异（P=0.878）,而纳米乳和SDS与Labrasol、Oleique之间均存在显著性差异（P=0.000）,Labrasol对Hacat细胞的抑制率显著高于纳米乳、SDS和Oleique。利多卡因纳米乳对Hacat细胞的半数抑制浓度IC₅₀显著高于SDS（P=0.049）,Labrasol的半数抑制浓度IC₅₀要显著低于利多卡因纳米乳（P=0.004）、Plurol Oleique（P=0.031）和SDS（P=0.001）。（二）利多卡因纳米乳和空白纳米乳对活体动物的皮肤均无刺激性,组织学结果也显示动物皮肤经利多卡因纳米乳处理后表皮结构完整,真皮未出现中性粒细胞浸润、血管扩张充血、血管周围炎性细胞浸润、血管炎、真皮水肿或出现成纤维细胞增生和纤维化等真皮组织炎性病理改变。七、利多卡因纳米乳药效学的初步实验研究结果显示纳米乳、EMLA和生理盐水导致豚鼠完整皮肤和破损皮肤组对刺激产生负反应均存在显著性差异（P=0.000）,纳米乳诱导豚鼠皮肤产生的负反应要多于EMLA,而EMLA要多于生理盐水对照（P=0.000）。豚鼠完整皮肤组涂药1h和受损皮肤组涂药0.5h后去除药物后,纳米乳和EMLA导致豚鼠完整皮肤组和受损皮肤组对刺激产生负反应均无显著性差异（P=0.502）,而纳米乳和EMLA组诱导豚鼠皮肤产生负反应数则均要高于生理盐水组（P=0.000）。结论一、通过伪三元相图结合Origin分析软件可以优化纳米乳的组方,确定纳米乳各组份在组方中的比例;马尔文粒径测定结合透射电镜分析对观察并测定微乳的粒径、分布、形态及体系类型效果较理想;所制备的空白纳米乳、荧光素OB-纳米乳和利多卡因纳米乳在理化性质方面均较为理想。二、纳米乳良好的透皮性主要来自于各种组份共同构成的完整组方体系,体系对皮肤除水合作用外,组方中的表面活性剂Labrasol和Plurol Oleique在一定程度上对皮肤角质层屏障进行剥脱从而促进纳米乳的透皮,并且,纳米乳体系能破坏棘细胞间的连接,扩张棘细胞间的间距,从而实现纳米乳的高效透皮,皮肤中毛囊、皮脂腺和汗腺等附属器对药物制剂的透皮也起一定的作用。三、纳米乳的形成,理化性质及透皮性高低依赖于表面活性剂的种类,但表面活性剂成份也是产生皮肤刺激性的主要因素,因此,筛选安全有效的表面活性剂应是纳米乳制剂研发的重点。四、利多卡因纳米乳的时间稳定性较好,但应在避光、常温下保存;利多卡因纳米乳的透皮性较酊剂和凝胶好,渗透吸收属于零级动力学过程。五、利多卡因纳米乳产生皮肤刺激性的原因主要由其中Labrasol组份产生,但小于目前公认的且已广泛应用于香波、洗衣粉中的轻微皮肤刺激阳性对照物SDS,因此局部皮肤外用利多卡因纳米乳应较为安全可靠,不会对皮肤产生刺激性和组织学病理改变。六、利多卡因纳米乳对完整皮肤和破损皮肤的麻醉起效时间优于EMLA乳膏,而局麻药效维持时间却与EMLA乳膏相当,表明利多卡因纳米乳在药效学方面优于EMLA乳膏。