研究背景失血性休克(hemorrhagic shock,HS)指短时间内失血超过总血量的25%-30%,超出机体代偿的能力,即引起心排出量和平均动脉压下降而发生休克,失血超过总血量的45%-50%往往迅速导致死亡。美国每年有大约90000的人死于意外受伤,而其中66-80%死于难以控制的大量失血。失血性休克是由于有效循环血量急剧减少、急性微循环障碍、组织灌注严重不足造成的组织器官缺血缺氧性损害的全身病理过程。HS的发展过程大致可以分为休克代偿期、可逆性失代偿期、不可逆性失代偿期。重症难治性休克,即不可逆性失代偿期,病人经积极的输血补液和缩血管素治疗以后,血压仍难以回升,病情进一步恶化,预后极差。重症难治性休克患者主要临床表现为,血压进行性下降,毛细血管无复流,微循环淤血不断加重和DIC的发生。目前认为,休克难治性除与DIC的发生有关,还与肠道缺血缺氧造成屏障和免疫功能降低、菌群和内毒素入血有关。迅速输血补液是抗休克的首要治疗方法,但造成的缺血/再灌注损伤对重症休克病人又是一次严重打击,不仅不能恢复组织器官功能,反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。现已证实多种组织器官都存在缺血再灌注损伤的现象,其中肠道既是损伤发生的靶器官,又是全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)的“启动器官”,肠道黏膜屏障的破坏可引起细菌和内毒素易位,造成远隔脏器的炎症和损伤,最终导致多器官功能障碍综合征(MultipleOrgan Dysfunction Syndrome,MODS)。因此,失血性休克再灌注的肠保护对休克病人的治疗和转归至关重要。随着线粒体研究的进展和技术的成熟,大量研究表明线粒体功能障碍是重症休克难治性和休克导致多器官功能衰竭的重要原因之一。线粒体是机体能量的来源,参与机体正常生理功能的调控。组织细胞的能量减少并非是血液灌流和营养物质不足造成的缺氧,而是由于线粒体自身受损造成ATP产生不足所致,即“细胞病性缺氧”,“细胞病性缺氧”的本质是线粒体功能障碍。我们前期的研究已经证明线粒体功能障碍是重症休克导致血管低反应性和顽固性低血压的重要原因之一,而且参与重症失血性休克的肾、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞损伤。那么,线粒体功能障碍是否也参与了重症失血性休克导致的肠道损伤呢?广泛的线粒体功能障碍造成多器官功能障碍。有些研究已证实,通过保护线粒体治疗可以保护失血性休克的多器官损伤,比如线粒体保护剂白藜芦醇(Resveratrol,RSV)和虎杖苷(Polydatin,PD)。针对线粒体保护的靶向治疗成为重症休克治疗的一种新策略,也是我们研究团队的主要课题。我室研究的抗休克药物PD既有改善微循环和增加营养物质供应的作用,又有减少氧自由基合成保护线粒体的作用。而且在失血性休克的大鼠再灌注损伤中,PD保护动脉平滑肌细胞和神经细胞线粒体功能的作用优于国际公认的线粒体保护剂RSV。虎杖苷是从中药虎杖的根茎中提取的第4种单体,化学结构为3,4,5-三羟基-3-13-D-单葡萄糖苷,也称为白藜芦醇苷,是白藜芦醇与葡萄糖的结合物,均属于虎杖成分中的芪类化合物。与RSV相比,PD有摄取吸收更快、含量最丰富、更高的氧自由基清除效率的优势。研究发现虎杖苷具有抗炎抗氧化,改善微循环,保护线粒体的功能。经过30年的研究开发,已获得中国国家I类新药临床试验批件(国家食品监督管理局批件2006L00301)用于烧伤和休克病人的治疗并进入II期临床实验。虎杖苷也渐渐成为公认的线粒体保护剂,但其中的机制还不清楚。人Sirtuins或沉默信息调节蛋白2 (Silencing Information Regulator2,Sir2)相关酶是一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的组蛋白去乙酰化酶的家族,包括SIRT1～SIRT7。这个家族基因在进化中高度保守,与能量代谢、细胞氧化状况等密切相关,是长寿与衰老研究领域的热点基因。我们实验室发现,SIRT1的表达和活性降低在失血性休克的小肠损伤中发挥了重要作用,PD通过上调SIRT1减轻小肠损伤。在研究氧化应激调节机制过程中,发现SIRT3能对线粒体内相关的靶蛋白脱乙酰基,通过增加活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)清除酶活性和稳定线粒体功能来抑制线粒体内ROS的蓄积,其高表达有抗氧化应激的作用。一些体内实验也证明,SIRT3通过依赖锰超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase,SOD2)的机制参与多种病理过程及疾病,比如肿瘤、衰老、辐射损伤、能量限制、非酒精性脂肪肝糖尿病等。正因为PD是抗氧化应激的线粒体保护剂,SIRT3是参与抗氧化应激的调节蛋白,那么PD的线粒体保护作用是否和SIRT3有关,又有怎样的关系呢?目的通过小肠上皮细胞IEC-6的氧化应激模型和大鼠的失血性休克模型探讨SIRT3和线粒体在失血性休克小肠损伤中的作用,为PD在失血性休克病人的临床应用提供新的理论依据。方法1.模型与分组1.1细胞氧化应激损伤模型的确立及分组H202的最适刺激条件：96孔板中培养融合度约90%的IEC-6细胞经不同浓度(0、25、50、100、250、500uM/L)H202溶液刺激不同时间(0、15、30、60、120min),用CCK8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测不同条件刺激组细胞的活性。以刺激后细胞活性下降20-30%为理想标准,独立重复实验三次以确定氧化应激模型的最适H202刺激浓度和时间。PD的最佳保护浓度：细胞经过不同浓度(0、25、50、100uM/L)的PD处理12小时,用CCK8试剂盒检测不同浓度PD处理组细胞的活性,独立重复实验三次以确定PD的最佳保护浓度。细胞不同处理分组：将生长良好的IEC-6细胞随机分为5组(n=6)。(i)空白对照组；(ii)溶剂预处理组；(iii)PD预处理组；(iv) PD+3-TYP (SIRT3选择性抑制剂,50uM/L)预处理组；(v)RSV预处理组(RSV 25uM/L)。预处理12小时后,最适条件的H2O2刺激,一定时间收集不同处理组的细胞做后续指标的检测。1.2大鼠失血性休克模型的建立及分组实验符合国际和中国的实验动物管理办法,并由南方医科大学动物饲养使用委员会批准。大鼠的休克模型参照本实验室既往的实验方案进行,即通过股动脉放血至30mmHg,维持2小时后回输血,继续观察2小时。实验动物随机分为五组(n=14)：假手术对照组(control组)、溶剂组(vehicle组)、虎杖苷治疗组(PD组),虎杖苷+抑制剂组(PD+3-TYP组)、白藜芦醇治疗组(RSV组)。每组6只大鼠用断颈法处死以组织提取和线粒体形态观察,8只撤去导管,缝合伤口做生存分析。2.检测指标2.1虎杖苷对氧化应激损伤小肠上皮细胞线粒体的影响通过检测线粒体跨膜电位(△ψm)、线粒体通透转变孔(MitochondrialPermeability TransitionPore,mPTP)开放和细胞内ATP含量来评价氧化应激对线粒体结构和功能影响,以及虎杖苷干预治疗的影响。△ψm越低,mPTP开放越多,细胞ATP含量越低,说明线粒体损伤越严重。2.2虎杖苷对氧化应激损伤小肠上皮细胞内氧化应激水平的影响通过流式技术检测DCF荧光评价不同处理组细胞ROS水平,荧光越强,ROS水平越高,说明氧化应激损伤越严重。2.3虎杖苷对失血性休克大鼠的小肠上皮细胞线粒体结构的影响收集失血性休克大鼠的小肠组织,制作成超薄组织切片,在透射电子显微镜下观察细胞线粒体的形态。正常细胞线粒体呈椭圆形,线粒体基质致密,嵴完整、排列整齐且结构正常,而损伤线粒体呈不规则形,肿胀明显,嵴排列紊乱或断裂,轮廓不清,线粒体基质透亮,呈空泡状。通过比较线粒体损伤程度评价虎杖苷对失血性休克肠损伤的干预作用。2.4虎杖苷对失血性休克大鼠小肠组织氧化应激水平的影响收集失血性休克大鼠的小肠组织匀浆,使用碧云天检测试剂盒检测各组的GSH/GSSG比例和丙二醛(MDA)含量来评价组织的氧化应激水平。GSH/GSSG比例越低,MDA含量越高,说明氧化应激水平越高。通过比较氧化应激水平来评价失血性休克的小肠损伤及虎杖苷的干预作用。2.5虎杖苷对失血性休克大鼠小肠细胞凋亡和大鼠生存时间的影响取失血性休克大鼠的小肠制成石蜡包埋的组织切片,使用Tunel细胞凋亡检测试剂盒定位出凋亡的小肠细胞,然后在显微镜下记录凋亡的细胞数目。凋亡细胞数越多,小肠损伤越严重。通过比较各组的凋亡细胞数,来评价失血性休克肠损伤和虎杖苷的干预作用。失血性休克大鼠撤去导管,缝合伤口,给予足够的饲料和水,观察并记录48h的生存时间。生存时间越短,说明失血性休克损伤越严重。通过比较不同治疗组的生存时间来评价失血性休克损伤和虎杖苷的干预作用。2.6虎杖苷的影响与组织、细胞内SIRT3的蛋白表达和活性的关系Western blot技术检测不同处理组SIRT3的蛋白表达水平；SIRT3活性检测试剂盒检测不同处理组SIRT3的酶活性。通过比较各组SIRT3的蛋白表达和酶活性来评估失血性休克对小肠SIRT3的影响及虎杖苷的干预作用。2.7虎杖苷的影响与组织细胞内SOD2的表达和活性的关系Western blot技术检测不同处理组SOD2、acetyl-SOD2蛋白表达水平；SOD2活性检测试剂盒检测不同处理组SOD2活性。通过比较各组SOD2、acetyl-SOD2蛋白表达和SOD2活性来评估失血性休克对小肠中SOD2的影响及虎杖苷的干预作用。结果1.细胞氧化应激模型模型的确立以刺激后细胞活性下降20-30%为理想标准,H2O2250uM/L,30min被确立为最适刺激条件,此时的细胞活性为正常对照74±2.2%。PD最佳保护浓度为50uM/L。2.虎杖苷对氧化应激损伤小肠上皮细胞线粒体的影响与正常对照组相比,H202刺激使小肠上皮细胞线粒体的结构和功能受损,线粒体跨膜电位(△Vm)降低,线粒体通透转变孔(mPTP)开放,细胞ATP含量降低。虎杖苷或白藜芦醇预处理可以减轻线粒体的氧化应激损伤,改善△m降低、抑制ψmPTP开放、促进ATP合成,并且二者作用相当。使用SIRT3选择性抑制剂3-TYP可以部分抑制虎杖苷对氧化应激线粒体损伤的保护作用。3.虎杖苷对氧化应激损伤小肠上皮细胞氧化应激水平的影响与正常对照组相比,H202刺激使小肠上皮细胞的ROS急剧增加,氧化应激水平增高,虎杖苷或白藜芦醇预处理可以降低ROS的产生,降低细胞的氧化应激水平,并且二者作用相当。使用3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷对氧化应激水平的影响。4.虎杖苷对失血性休克大鼠的小肠细胞线粒体结构的影响与假手术对照组相比,失血性休克大鼠的小肠线粒体形态明显受损,呈不规则形,肿胀明显,嵴排列紊乱或断裂,轮廓不清,线粒体基质透亮,呈空泡状,虎杖苷或白藜芦醇预处理可以减轻线粒体形态的改变,甚至接近正常线粒体形态。使用3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷这种线粒体保护作用。5.虎杖苷对失血性休克大鼠小肠组织氧化应激水平的影响与假手术对照组相比,失血性休克大鼠小肠组织的GSH/GSSG比率降低,MDA水平升高,失血性休克造成细胞过度氧化。虎杖苷或白藜芦醇预处理可以改善GSH/GSSG比率降低和MDA水平升高,发挥抗氧化应激作用。3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷这种抗氧化应激作用。6.虎杖苷对失血性休克大鼠小肠细胞凋亡和大鼠生存时间的影响与假手术对照组相比,失血性休克大鼠小肠细胞凋亡增加,大鼠生存时间短。虎杖苷或白藜芦醇预处理可以减少失血性休克导致的细胞凋亡,延长大鼠的生存时间。3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷的这种保护作用。7.虎杖苷的干预与组织、细胞内SIRT3的蛋白表达和活性的关系与对照相比,模型组SIRT3的蛋白表达降低,酶活性下降,虎杖苷或白藜芦醇预处理可以降低H2O2刺激和失血性休克SIRT3的影响,使蛋白表达轻微升高,酶活性极大升高。3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷对SIRT3的影响,但未抑制SIRT1的活性和表达。8.虎杖苷的干预与组织、细胞内SOD2的表达和活性的关系与对照相比,模型组SOD2表达降低,acetyl-SOD2表达增加,导致SOD2酶活性下降,虎杖苷或白藜芦醇预处理可以降低H2O2刺激和失血性休克对SOD2的影响,使SOD2表达轻微增加,acetyl-SOD2表达极大降低,SOD2酶活性升高。3-TYP抑制剂可以部分抑制虎杖苷对SOD2的影响。结论1.重症失血性休克小肠细胞发生了线粒体损伤。2.虎杖苷减轻重症失血性休克小肠损伤,延长休克大鼠生存时间。3.虎杖苷保护失血性休克小肠损伤与其线粒体保护有关。4.虎杖苷的线粒体保护可能与SIRT3-SOD2通路的激活有关。5.虎杖苷可能是SIRT3的激活剂。