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研究背景慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是指各种原因导致的慢性肾脏结构的改变或者功能障碍超过三个月的一类慢性疾病。随着我国人口的老龄化及代谢性疾病的增多,CKD的发病率逐年升高,给家庭和社会带来了沉重的经济负担。终末期肾病（End stage renal disease,ESRD）是CKD的终末事件,然而目前尚无针对该疾病的特异性药物。肾纤维化是各种CKD发展为ESRD的共同通路,是肾功能丧失的重要原因之一,尽管过去几年我们对肾纤维化的认识有了大幅度的提升,但目前疾病的具体机制仍未完全阐明,因此研究肾纤维化的病理发生机制和特异性靶点,对于疾病的预防和治疗具有十分重要的意义。炎症在肾纤维化的病理发生中扮演着重要的角色,而巨噬细胞作为免疫系统的重要成员之一,同样也对炎症调节起着重要的作用。巨噬细胞在不同的刺激下可以极化为经典活化的M1型巨噬细胞和替代活化的M2型巨噬细胞。目前研究表明,纤维化肾组织中有大量的巨噬细胞浸润,且其极化在肾纤维化的病理发生过程中非常重要,M1型巨噬细胞主要是通过促进肾脏损伤加速肾纤维化的发展,M2型巨噬细胞主要通过促进细胞外基质的沉积和促纤维化因子的分泌介导肾纤维化的病理发生。纤维蛋白原样蛋白2（Fibrinogen-like protein 2,Fgl2）作为一种凝血酶原酶,具有凝血活性和免疫调节双重作用。最新研究发现,Fgl2可以通过调节炎症反应参与多种疾病的病理发生,而炎症又是肾纤维化发生的核心环节,因此我们推测Fgl2可能参与了肾纤维化的发生发展。本研究通过建立单侧输尿管结扎（Unilateral ureteral obstruction,UUO）诱导的肾纤维化模型,通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）、蛋白质免疫印记（Western Bolt,WB）流式细胞术（Flowcytometry,FCM）和定量实时PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）等技术探讨了Fgl2对巨噬细胞极化的调节作用。研究目的:1.探讨Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响。2.探讨在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用。研究方法1.Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响1.1收集CKD病人肾脏组织标本,IHC检测肾组织中Fgl2的表达。1.2收集Fgl2+/+小鼠UUO术后3d或7d或14d的小鼠肾组织,IHC、WB和qRT-PCR检测小鼠肾组织中Fgl2的表达。1.3收集Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠UUO术后7d的肾组织,进行以下实验:（1）IHC、WB和qRT-PCR检测小鼠肾组织中α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）、胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）和纤连蛋白（Fibronectin）的表达。（2）Masson染色检测Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠肾组织中胶原纤维的沉积。（3）qRT-PCR检测小鼠肾组织转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）的表达。2.在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用2.1收集Fgl2+/+小鼠UUO术后14d的肾组织,免疫荧光检测纤维化肾组织中巨噬细胞（F4/80+）上Fgl2的表达情况。2.2收集Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠UUO术后7d或14d的肾组织,进行以下实验:（1）流式细胞术检测小鼠肾组织中巨噬细胞（F4/80+CD11b+）、M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+MHC-Ⅱ+）和M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD206+）的比例。（2）qRT-PCR检测小鼠肾组织中M1型巨噬细胞相关分子（诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）、IL-12p40、IL-6和IL-1β）和M2型巨噬细胞相关分子（甘露糖受体（Mannose receptor,MR）、精氨酸酶1（Arginase-1,Arg-1）、IL-10、炎症区分子1（Found in inflammatory zone-1,Fizz-1）、类几丁质酶3样分子（Chitinase 3-like 3,即YM-1）、TGF-β1）的表达。2.3巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage concolony stimulating factor,M-CSF）诱导Fgl2+/+和Fgl2-/-小鼠的骨髓细胞分化成为骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-derived macrophages,BMDM）,然后分别加入脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）或IL-4诱导BMDM向M1型巨噬细胞或M2型巨噬细胞极化。（1）流式细胞术检测Fgl2+/+和Fgl2-/-来源的BMDM中M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例。（2）qRT-PCR检测Fgl2+/+和Fgl2-/-来源的BMDM中M1型巨噬细胞相关分子（iNOS、IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α）和M2型巨噬细胞相关分子（MR、Arg-1、Fizz-1和YM-1）的表达。实验结果1.Fgl2基因缺失对肾纤维化病理发生的影响1.1与正常肾组织相比,Fgl2的表达在CKD病人肾组织中显著升高。1.2与假手术组小鼠相比,Fgl2的表达在UUO诱导的小鼠纤维化肾组织中明显升高。1.3在UUO手术后7d,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠的肾组织纤维化更严重,表现为α-SMA、胶原蛋白Ι和纤连蛋白的表达、促纤维化因子TGF-β1的分泌、胶原沉积（Masson染色）增多。2.在肾纤维化的病理发生过程中,Fgl2对M1型和M2型巨噬细胞极化的作用2.1在UUO手术后14d,Fgl2高表达于小鼠纤维化肾组织中浸润的巨噬细胞上。2.2在UUO手术后7d或14d,在Fgl2+/+小鼠和Fgl2-/-小鼠肾组织中巨噬细胞（F4/80+CD11b+）、M1型巨噬细胞（F4/80+CD11b+MHC-Ⅱ+）的百分率无明显差异,但Fgl2基因敲除后M2型巨噬细胞（F4/80+CD11b+CD206+）的百分率显著增多。2.3在UUO手术后7d,在Fgl2+/+小鼠和Fgl2-/-小鼠肾组织中,M1型巨噬细胞相关分子的表达均无明显变化,但Fgl2基因敲除后部分M2型巨噬细胞相关分子（MR,TGF-β1）的表达明显增多。2.4在UUO手术后14d,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠肾组织中部分M1型巨噬细胞相关分子（IL-12p40和TNF-α）和M2型巨噬细胞相关分子（MR、TGF-β1、IL-10和Fizz-1）表达明显增多。2.5在BMDM向M1型巨噬细胞极化过程中,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠来源的BMDM中M1型巨噬细胞的百分率及其相关分子表达（iNOS、IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α）明显增多。2.6在BMDM向M2型巨噬细胞极化过程中,与Fgl2+/+小鼠相比,Fgl2-/-小鼠来源的BMDM中M2型巨噬细胞的百分率及其相关分子表达（MR、Arg-1和Fizz-1）明显增多。结论1.Fgl2在纤维化肾组织中高表达。2.Fgl2基因敲除促进UUO诱导的肾纤维化的病理发生。3.Fgl2基因敲除可以通过促进巨噬细胞的极化介导肾纤维化的病理发生。