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H5亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)可导致家禽的高发病率和高病死率,在中国、越南、印度尼西亚、印度、孟加拉国和埃及呈地方流行性(联合国粮农组织,http://www.fao.org),给养禽业带来了巨大的经济损失。H5亚型AIV具有跨种传播的能力,可感染人并导致较高的病死率,对人类的健康安全构成巨大的潜在威胁。血凝素蛋白作为AIV表面最重要的糖蛋白,是流感病毒最主要的毒力因子之一,它包含多个N-糖基化位点,在内质网和高尔基体内进行糖基化修饰。随着H5亚型AIV不断进化,HA蛋白表面糖基化位点分布模式日益复杂,糖基化位点的缺失或增加影响着病毒的抗原性和毒力。目前我国家禽中流行的H5亚型AIV主要分布于2.3分枝中的 2.3.4.4 和 2.3.2.1 分枝,本研究以 AIVA/Mallard/Huadong/S/2005(H5N1,Clade2.3.4)及其HA糖基化位点突变株为模型,深入研究了 HA蛋白糖基化位点的改变对病毒毒力的影响,并探讨其可能的机制。1.H5N1亚型AIV HA茎部10/11位糖基化修饰对病毒致病性的影响H5亚型AIVHA蛋白茎部的糖基化位点相对保守,在维持HA蛋白三聚体的稳定性方面发挥主要作用。前期研究表明,茎部第10/11位重叠糖基化位点可能对HA蛋白裂解产生影响,但不能确定哪一位点起着关键作用。本试验以H5N1亚型AIV A/Mallard/Huadong/S/2005(S株)为母本,通过定点突变和反向遗传技术构建了 3种HA蛋白茎部糖基化位点缺失的重组病毒(rS-Δ10、rS-Δ11和rS-Δ10/11),并对其生物学特性和致病性进行了测定。结果显示,S株茎部第10位和第11位都可进行糖基化修饰。相较于野生型病毒(rS)来说,这三种重组病毒都表现出对热及低pH的不稳定性。但是在病毒传代过程中,rSY-Δ11和rSY-Δ10/11极易发生回复现象。rS-Δ11和rS-Δ10/11在CEF细胞上的增殖速率显著低于rS-Δ10和rS。同时,Western-blot检测发现rS-Δ11和rS-Δ10/11的HA0蛋白裂解时间较rS-Δ10和rS有明显的延迟。小鼠致病性试验显示,rS-Δ11和rS-Δ10/11的毒力显著低于rS-Δ10和rS。因此,H5N1亚型AIV S株茎部第1 1位糖基化位点对于病毒HA蛋白裂解至关重要并可影响其毒力。2.H5N1亚型AIV HA头部糖基化修饰对诱导细胞内质网应激的影响前期研究发现,去除S株H5亚型AIV头部第158和169位(H3 numbering)糖基化位点能显著增强其对哺乳动物的毒力,然而具体机制尚不明确。本试验选择了 S株及144、158和169位头部糖基化位点突变的毒株,对其生物学特性和可能影响的宿主信号通路进行了研究。结果显示,相较于野生毒株(rS-144-/158+/169+),158位(rS-144-/158-/169+)和169位rS-144-/158+/169-)HA蛋白头部糖基化位点缺失毒株感染A549细胞能诱导更高的IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-Α表达,但是病毒的TCID50、EID50和MDT却无显著差异。进一步研究发现rS-144-/158-/169+和rS-144-/158+/169-毒株感染A549细胞均能诱导更强烈的内质网应激。通过siRNA沉默及药物抑制的方法抑制细胞内质网应激下游IRE1α通路可以减少AIV诱导的炎症。Kira6体内给药试验证明抑制内质网应激可有效降低病毒感染小鼠的致病力。综上所述,H5亚型AIVHA头部糖基化位点的缺失能通过增强内质网应激介导更强烈的炎症,进而提高病毒毒力,其中rS-144-/158-/169+毒株感染细胞后能激活IRE1α通路下游的所有通路(JNK、XBP1和NF-κB)而rS-144-/158+/169-毒株感染细胞后仅仅能激活IRE1α通路下游的JNK通路。3.H5N1亚型AIV HA头部糖基化修饰对诱导细胞高尔基体应激的影响高尔基体作为内质网的下游细胞器,其主要功能是帮助经内质网初步修饰的蛋白进行进一步修饰,并将蛋白运输至目标位置。为了探究AIV感染细胞后是否会进一步引起细胞高尔基体应激,选择H5亚型AIVS株,检测了病毒感染细胞后高尔基体功能形态及应激通路。结果显示AIV感染后会导致细胞高尔基体应激,表现为高尔基体肿胀破碎。同时,AIV能诱导高尔基体下游通路中TFE3通路的强烈激活,而HSP47通路呈现先激活后抑制状态,CREB3-ARF4通路呈现不激活状态。另外,相较于野生毒株(rS-144-/158+/169+),158 位(rS-144-/158-/169+)HA 蛋白头部糖基化位点缺失毒株感染A549细胞能更早地诱导细胞高尔基体破碎,rS-144+/158-/169+毒株则相对较迟地诱导细胞高尔基体破碎。但是rS-144-/158+/169-和rS-144+/158+/169-毒株诱导高尔基体破碎时间与野生毒株无显著差异。各头部糖基化位点突变株在激活TFE3通路方面无显著差异,而rS-144-/158-/169+则在感染12 h时较野生毒株更强烈地激活HSP47通路,其余时间点各糖基化位点突变株无显著差异。因此,H5亚型AIV可引起高尔基体应激,并激活HSP47和TFE3通路;与野生株相比,rS-144-/158-/169+能诱导更强的高尔基体应激,rS-144-/158+/169-能诱导相似高尔基体应激。4.H5N1亚型AIV HA头部糖基化修饰对诱导细胞铁死亡的影响为了进一步研究糖基化位点对AIV毒力的影响。将H5亚型AIV S株感染A549细胞,着重检测了 AIV感染后细胞铁死亡水平。结果显示,AIV感染细胞造成细胞抗氧化分子合成受阻,具体表现为SLC7A11和GPX4蛋白表达量随着AIV感染时间逐渐下降,还原性谷胱甘肽随着AIV感染逐渐消耗殆尽。同时COX2的表达量随着AIV感染时间逐渐上升。对细胞脂质过氧化物及细胞铁离子聚集的检测证明AIV感染A549细胞可以诱导细胞铁死亡。通过药物抑制的办法抑制细胞铁死亡可以显著降低细胞的LDH含量并部分恢复细胞活力。相较于野生毒株(rS-144-/158+/169+),158位(rS-144-/158-/169+)HA蛋白头部糖基化位点缺失毒株感染A549细胞能诱导更高水平的细胞铁死亡,rS-144+/158-/169+毒株则仅能诱导相对较低水平的细胞铁死亡。但是rS-144-/158+/169-和rS-144+/158+/169-毒株诱导细胞铁死亡水平与野生毒株无显著差异。因此,H5亚型AIV感染后能诱导细胞铁死亡。与野生株相比,rS-144-/158-/169+能诱导更强的铁死亡,rS-144-/158+/169-能诱导相似的铁死亡。