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目的:1.高效、稳定的体外培养大量的骨髓间充质干细胞(BMSCs),并对BMSCs进行细胞生物学鉴定。2.观察梓醇对BMSCs的细胞增殖作用,深入探讨梓醇对BMSCs促成软骨分化的作用。3.观察梓醇对体外BMSCs细胞迁移的影响,进一步研究梓醇在促细胞迁移过程与Wnt非经典信号通路Wnt5a/CaMKII的关系。方法:1.应用全骨髓贴壁法培养SD大鼠BMSCs,取状态良好的第3代BMSCs行细胞表面抗原流式细胞检测及诱导成脂肪、成骨细胞分化。2.CCK-8法检测梓醇对BMSCs增殖的影响,RT-PCR检测梓醇对BMSCs分化为软骨细胞的特异性基因COLⅠ、Aggrecan和SOX9基因的表达。3.Transwell法观察梓醇对BMSCs细胞迁移的影响,并通过构建过表达Wnt5a慢病毒载体的方法感染BMSCs。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白荧光表达及RT-PCR检测Wnt5a基因的表达量确定慢病毒感染效果。进一步Western-blot检测慢病毒感染BMSCs中CaMKII的表达来观察梓醇对其下游CaMKII蛋白的影响。结果:1.流式细胞检测细胞表面抗原标志物结果显示CD29、CD44、CD90阳性率分别为99.84%、96.80%、99.99%,阳性率均大于95%;表达造血细胞的标记物CD45仅仅为4.35%,阳性表达率≤5%。及在成骨及成脂肪诱导条件均能实现成骨及成脂分化,逆向证明体外分离培养的细胞是BMSCs。2.梓醇干预的各组BMSCs在12h便开始出现细胞增殖,且随时间的增加,细胞的增长率也不断增长,24h后梓醇促BMSCs增长率可达86.0%,在36h细胞依旧保持高速的增殖速度,达到最高的130.77%。不同浓度的梓醇在处理BMSCs在各研究时段内都可促进BMSCs增殖,梓醇25μmol/L浓度组在12h干预BMSCs便出现增殖,随着梓醇浓度增加和作用时间的延长,BMSCs增殖效果的明显增加,与空白正常组比较均有统计学意义(P<0.01)。3.RT-PCR结果显示与空白组比较,高、中、低剂量梓醇组都可以提高COL1、SOX9的mRNA的表达(P<0.01);高剂量的梓醇150μmol/L组和中剂量的梓醇100μmol/L组及经典诱导组都可提高Aggrecan基因的表达,与空白组比较(P<0.01);与经典诱导组比较,低、中剂量的阳性梓醇组可以提高COL1基因的表达(P<0.05),高剂量梓醇可提高Aggrecan基因的表达(P<0.05);高、中、低剂量梓醇组都可以提高SOX9的mRNA的表达。与空白比较,低剂量梓醇组对Aggrecan mRNA的表达无统计学意义。4.Transwell实验表明:与空白对照组下室的细胞数比较,50、100μmol/L浓度梓醇干预BMSCs 12h后的穿膜下室细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);而200μmol/L的梓醇下室细胞较100μmol/L浓度组明显减少,说明最佳梓醇促BMSCs迁移浓度为100μmol/L,差异有统计学意义(P<0.01)。5.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白荧光表达及RT-PCR检测Wnt5a基因的表达量结果显示BMSCs过表达Wnt5a基因。6.Western-blot结果显示:与空白组比较,梓醇组及梓醇+过表达Wnt5a组的CaMKII蛋白表达都明显升高(P<0.01),且梓醇+过表达Wnt5a组CaMKII蛋白表达最高(P<0.01)。结论:梓醇可促进BMSCs增殖、成软骨分化及体外迁移能力,其机制可能Wnt非经典通路Wnt5a/CaMKII相关。