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研究背景
全世界乙型肝炎病毒感染者超过3.5亿人，每年大约有100万患者死于慢性乙型肝炎(CHB)的并发症：肝硬化、肝癌、终术期肝病。因此针对HBV的抗病毒治疗受到广泛重视，随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBVDNA复制的核苷类药物(如：拉米夫定、阿德福韦酯)逐步成为抗HBV治疗的新选择。拉米夫定耐受性好且用药后短期内能有效抑制HBVDNA复制，但长期治疗易出现耐药性，拉米夫定基因耐药性在治疗1、2、3年时为14％、38％、53％。
针对耐拉米夫定的患者，国外主要采用阿德福韦酯替代或联合拉米夫定治疗。阿德福韦酯是单磷酸腺苷的核苷酸类似物，能有效地抑制HBVDNA的复制，使HBVDNA载量迅速降低，而且在出现拉米夫定耐药的患者中阿德福韦酯能继续有效地抑制变异株。目前发现rtN236T与rtAl81V变异与阿德福韦酯耐药相关，阿德福韦酯治疗2年的耐药发生率为1.6％。阿德福韦酯耐药伴随HBVDNA的反弹和肝功能的恶化。
阿德福韦酯已在我国上市用于治疗慢性乙型肝炎，随着临床用药的普及，进行阿德福韦酯耐药变异株的研究，防治耐药变异株产生非常重要。
研究目的
1.分析阿德福韦酯治疗前、后慢性乙型肝炎患者生化学及病毒学应答，发现其变化规律，以指导临床用药。
2.对阿德福韦酯治疗前后乙肝病毒全基因组序列进行生物信息学分析，以期发现新的耐药位点，并探讨其与临床耐药的关系。
3.将阿德福韦酯治疗不同时期患者血清中HBV毒株在体外转染HepG2细胞，探讨其在体外细胞中的抗原表达及转录水平的变化规律。
4.成功获得HBV基因组克隆，为后续的HBVDNA生物信息学分析、耐药研究打下基础；将获得的HBV基因组体外瞬时转染HepG2细胞技术，为研究HBV在细胞中的复制特性、抗原表达及转录水平变化等打下基础。
材料
我们采集了13份阿德福韦酯治疗前及治疗后28周、52周、92周的CHB患者的血清，分别测定其HBVDNA载量和ALT水平。对其中4例患者4个时段的系列血清进行HBV全基因组克隆、测序，对测序结果进行生物信息学分析。将经过测序证实含有HBV基因组的克隆，经SapI酶切回收3.2KbHBVDNA并转染到HepG2细胞中，分析其在体外的抗原表达特性及转录水平的变化规律。
方法
1.采用实时荧光定量PCR法检测血清HBVDNA载量：血清HBVDNA载量以拷贝/毫升表示，试剂盒的检出限度为1x1O3基因拷贝/毫升。实验重复三次，结果取平均值。
2.HBV全基因组扩增、克隆及序列测定：采用长片段PCR方法一次扩增HBV全基因组并克隆入载体，筛选阳性克隆、酶切鉴定并进行序列测定。
3.HBV全基因组瞬时转染HepG2细胞：用SapI酶切重组质粒获得完整的HBV基因组，采用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞，在转染后24h、48h、72h分别收集细胞上清，用AbbottIMX试剂检测上清中HBsAg和HBeAg的表达情况。提取转染后48h细胞内总RNA，逆转录为cDNA，并采用荧光定量PCR方法检测其转录水平变化情况。转染实验从用SapI酶切并回收HBVDNA全基因组开始，分别重复3次。
结果
1.阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎中病毒学应答的规律
用阿德福韦酯治疗的13例CHB患者中，发现5例在治疗52周时HBVDNA载量出现反弹，在52周-92周时段，HBVDNA载量再次下降。BL-28周时段HBVDNA的下降趋势和52周-92周之间HBVDNA的下降趋势存在正相关(R=0.643，P=0.018)。1例在治疗92周时HBVDNA载量出现反弹。
2.HBV全基因组扩增、克隆技术
本研究采用一片段法扩增全长HBV，并在设计引物时引入两个酶切位点SalI、NotI，利用双酶切进行克隆，克隆阳性率达90％以上。
3.阿德福韦酯治疗慢乙肝过程中HBV核酸序列的变化
HBV全基因组序列分析发现，阿德福韦酯治疗引起HBV基因变异的特点是：P、C、S、X-ORF均可发生变异，变异率由高到低依次是P、X、S、C。229.16周及233.52周均在P基因反转录酶区出现477位点N477S/G变异，伴随HBVDNA较变异前反弹。存在前C区ntG1896A变异的血清HBVDNA载量下降缓慢；C区3个变异位点(3/8)位于Th细胞表位；299号患者阿德福韦酯治疗52周、92周时均出现了BCP区A1762T/G1764A联合点突变。S基因中8(8/10)个变异位点位于HBsAg“a”主要决定簇与P基因A、B区的重叠部分。X基因变异主要位于负性调节元件和增强子II(EnhII)区域。
4.HBV全基因组瞬时转染Hep62细胞
HBVDNA体外瞬时转染HepG2细胞获得成功，转染效率高达30％。转染后24h、48h、72h细胞上清中均能检测到HBeAg和HBsAg的表达，转染后48h表达最强。
阿德福韦酯治疗前后CHB患者体内HBV毒株在体外转染细胞中的转录水平变化规律为：纵向来看，阿德福韦酯治疗后患者血清中HBV毒株在HepG2细胞中转录水平随治疗时间延长逐渐降低。但横向来比，不同患者之间HBV毒株之间转录水平无明显差别。
结论
1.我们成功获得了4例阿德福韦酯治疗前、治疗后28周、52周、92周共4个时段16份HBV基因组克隆。
2.在部分病例发现阿德福韦酯治疗后HBVDNA载量出现波动，呈现52周时反弹而52周-92周时再次出现下降的特点。其变化规律可能对临床疗效评估和及早发现耐药有一定意义。
3.在阿德福韦酯治疗的病人中发现：前CntG1896A变异可能引起HBVDNA载量下降缓慢；阿德福韦酯治疗有可能导致BCP突变的出现；在HBVP基因反转录酶区发现了有意义的变异位点，可能和阿德福韦酯耐药相关。
4.我们成功地将获得的16份HBV基因组体外转染HepG2细，且从抗原表达及mRNA检测方面证实转染成功，为后续耐药相关基因或因子的研究打下了基础。