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Micromonospora sp.SCSIO04089是一株从南海北部水深3025米处沉积物中分离到的小单孢菌,通过优化发酵条件,发现该株菌能产生丰富的具有良好生物活性的聚酮类化合物。现已从SCSIO04089中分离出聚酮化合物89-17D及6个可能为其二聚体衍生物的同系物,推测这些化合物可能有良好的生物活性。根据全基因组扫描和生物信息学分析,鉴定了化合物89-17D的生物合成基因簇,它与已发表的菌株Salinispora tropica CNB-440的产lomaiviticins类化合物的生物合成基因簇高度相似。两者的区别在于,89-17D的基因簇中多出2个额外的开放阅读框(orf) orf44和orf45。89-17D生物合成基因簇大小约为63 kb,由58个开放阅读框组成。生物信息学分析显示,在58个开放阅读框中,16个为PKS相关的基因,8个ORFs为转运或抗性相关的基因,13个为负责糖基基团和糖基化合成的基因,剩余的21个为未知或其他的基因。 论文中以SuperCos1为载体构建了SCSIO04089的基因组文库,并通过PCR的方法筛选出10个重叠的(pCSG4000-pCSG4010)拼接后能够覆盖89-17D整个生物合成基因簇的质粒。为了对Micromonospora sp.SCSIO04089进行基因灭活研究,通过同源重组构建了SCSIO04089的E.coli介导的接合转移遗传操作体系。随后,对SCSIO04089体内敲除了20个与89-17D生物合成相关的基因,其中包括4个氧化还原酶基因(orf12,orf15-orf17),2个糖合成相关的基因(orf44 andorf45),2个糖基转移基因(orf40 and orf49),6个预测与重氮形成相关的基因(orf28-orf30,orf32-orf34),链延伸因子的基因(orf53)和未知功能的基因(orf10)。根据基因敲除突变株发酵产物的HPLC检测分析,大部分突变株的中间体产量较低,导致化合物分离鉴定困难。LC-MS分析突变株的发酵产物发现,两个FAD依赖型的单加氧酶ORF23和OR27参与了化合物由6/6/6/6形成6/6/5/6的环的重排过程。此外,在E.Coli中对蛋白ORF18,ORF23,ORF27进行了表达纯化,以进行后期的生化分析研究。突变株Δorf23,Δorf40,Δorf44,Δorf45和Δorf49的中间体产量较高,通过放大培养尝试分离鉴定Δorf40和Δorf49的中间体,但皆因化合物不稳定而分离失败。 综上所述,我们克隆鉴定了89-17D的生物合成基因簇,并结合生物信息学分析和基因敲除结果推导了89-17D的生物合成途径。尽管放大培养分离中间体失败,但这为后期的优化和分离鉴定提供了重要线索。这项课题为后期深入研究89-17D和lomaiviticins类化合物的生物合成机制研究奠定了基础,并为利用组合生物合成技术获取更多的类似物开辟了道路。