论文部分内容阅读
目的：基于甲胎蛋白（AFP）对肝癌的发生发展及预后判断具有重要意义，以及前期正肝方具有较好防治肝癌前病变的临床及实验研究结果，本文应用RNAi技术构建AFP表达缺失的人肝癌HepG2细胞系（AFPsiRNA-HepG2细胞系）作为研究工具，观察AFP对肝癌细胞系HepG2的影响，以及正肝方对表达AFP肝癌细胞系和AFPsiRNA-HepG2细胞系的药效学差异，从而阐释AFP依赖机制是否是正肝方防治肝癌前病变的重要药理机制。方法：本论文分为四个部分。1.制备正肝方大鼠血清，应用Alamar blue方法筛选药物血清作用浓度及药物作用时间，干预人肝癌HepG2细胞系，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法测GGT水平，化学发光法和Western blot法检测AFP的表达，Hoechst33258染色观察细胞核形态，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡，RT-PCR检测细胞端粒酶逆转录酶基因的表达。2.通过http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/网站软件设计基因干扰靶点序列，模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5’端添加T，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加AGCT，与XhoI酶切后形成的粘端互补。正义链:5’-T-（GN18）-（TTCAAGAGA）-（N18C）-TTTTTTC-3’，反义链：3’-A（CN18）-（AAGTTCTCT）-（N18G）-AAAAAAGAGCT-5’。按此规则选择4个干扰靶点，分别记为AFP-639，AFP-1020，AFP-1432，AFP-1811。合成靶点序列，构建并鉴定质粒，包装、纯化病毒载体，转染，细胞计数计算感染效率，Western blot及RT-PCR检测各组AFP基因及蛋白的表达情况。选择干扰效率最高组，大量病毒包装构建AFPsiRNA-HepG2细胞系，Westernblot及RT-PCR检测AFPsiRNA-HepG2细胞及其传代后AFP基因及蛋白的表达。3.不同浓度外源性AFP干预AFPsiRNA-HepG2细胞系，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法检测GGT水平，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡，RT-PCR检测细胞端粒酶逆转录酶基因的表达。4.将AFPsiRNA-HepG2细胞分为8组，按5%正常大鼠血清、5%药物血清、10%正常大鼠血清、10%药物血清、AFP+5%正常大鼠血清、AFP+5%药物血清、AFP+10%正常大鼠血清、AFP+10%药物血清加入干预，24h后，MTT法检测细胞增殖情况，试剂盒法检测GGT水平，流式细胞术检测细胞的周期及凋亡。结果：1.Alamar blue结果提示，20%血清浓度组正常大鼠血清及中药大鼠血清有明显细胞毒性作用，所以选择5%、10%两个浓度组进行实验。药物干预时间为24h；与正常大鼠血清组比较，5%、10%药物血清组有显著阻滞细胞周期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并下调细胞AFP基因及蛋白的表达，下调端粒酶基因的表达；5%、10%药物血清组显著改变细胞核形态结构；药物血清组对细胞GGT的表达无影响。2.选择的四个靶序列，腺病毒少量包装后转染，计算感染效率，并测细胞AFP基因及蛋白的表达，结果提示，与野生型人肝癌HepG2细胞比较，靶点“AFP-639”干扰效率最高（97%）。选择靶点“AFP-639”构建细胞模型（AFPsiRNA-HepG2），模型细胞传代后仍能稳定地沉默AFP基因及蛋白的表达，沉默效率达87%左右。3.大剂量AFP（100ug/ml）抑制AFPsiRNA-HepG2细胞增殖，阻滞细胞周期，下调端粒酶基因表达，并诱导其凋亡，小剂量AFP（≤10ug/ml）能促进细胞增殖，缩短细胞周期。不同剂量AFP对细胞GGT水平无影响。4.无AFP共同干预时，与正常大鼠血清组比较，5%、10%药物血清组对细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及GGT水平均无影响。有AFP共同干预时，AFP+正常大鼠血清组比较，AFP+药物血清组将细胞周期阻滞于G0/G1期，显著抑制细胞增殖，延长细胞周期，诱导细胞凋亡；5%、10%药物血清组对细胞GGT水平无显著影响。结论：1.在体外实验中，正肝方药物血清显著下调肝癌细胞AFP的表达，抑制细胞生长并诱导其凋亡。2.应用RNAi技术成功构建了AFP表达缺失的人肝癌模型细胞系（AFPsiRNA-HepG2）。3.低浓度AFP有促进AFPsiRNA-HepG2细胞增殖作用。4.正肝方依赖抑制AFP对肝癌细胞的促增殖作用防治肝癌前病变。