目的:肛门直肠畸形（Anorectal malformations,ARMs）是小儿消化系统最常见的消化系统先天畸形之一,通常表现为肛门闭锁、异位肛门、直肠尿道瘘等,疾病发生率约1/5000¹/1500。ARMs通常合并其他系统畸形,大多ARMs患者需要进行手术治疗,但是长期随访结果发现,很多ARMs患者术后存在便秘、便失禁等并发症,严重影响生活质量和心理健康。所以,深入了解ARMs的发病机理并基于此提供更好的治疗方法意义十分重大。在肛门直肠发育过程中,尿道直肠隔与泄殖腔膜的融合、直肠和尿道的完全分离以及直肠末端与外界贯通是肛门形成的必要条件。当这一过程在内外界因素下受阻时,就可能出现发育异常而形成肛门直肠畸形。在研究ARMs时,因临床标本难以获取,一般采用实验动物模型进行研究,其中,ETU（Ethylenethiourea,乙烯硫脲）诱导的肛门直肠畸形大鼠胚胎是研究ARMs最常用的动物模型。形态学研究发现,ARMs畸形胚胎的主要表型包括:（1）尿道直肠隔和泄殖腔膜未融合;（2）尾肠退化延迟;（3）泄殖腔壁异常细胞凋亡;（4）背侧泄殖腔及背侧泄殖腔膜发育缺陷。而在此过程中,胎龄15、16天是尿生殖隔与泄殖腔膜融合、肛门形成的重要时期,若在大鼠胎龄16天仍未出现肛门,或尿道和直肠之间仍然存留通道时,则说明肛门直肠畸形不可避免地发生。ARMs病因复杂,遗传、环境等因素都可能引起疾病表型。既往研究表明,多种基因的异常表达可能参与ARMs发病过程,而研究最多的信号通路有Wnt、Notch、Shh、TGF-β等。但是,具体的发生机制仍不明确,需要深入研究。近年发现的miRNA（microRNA）可通过结合靶mRNA的3’-UTR来对靶基因进行转录后水平调控。据报道,miRNA在多种先天性疾病的发生和多个系统的胚胎发育中均有重要影响。既往研究结果提示miRNA在多个物种的消化道发育过程中发挥作用,miRNA异常可引起多种消化道疾病。然而,目前对于ARMs发展中miRNA功能的理解仍然有限。对比正常和肛门直肠畸形组织中miRNA表达谱有助于揭示miRNA在ARMs发生过程中的作用,从而为肛门直肠畸形发病机制提供有价值的基础。本研究中,我们选择肛门直肠发育关键时期（即胎龄14-16天）的胎鼠进行研究,对比了正常和ETU致畸的肛门直肠畸形胎鼠后肠组织中miRNA表达谱,结合生物信息学分析,寻找差异表达的miRNA。而后对关键miRNA进行动物水平、细胞水平和分子水平的探索,以期明确在ARMs发生过程中起重要作用的miRNA及其相关分子机制。研究方法:1、肛门直肠畸形动物模型制备和标本收集。所用动物为7-9周龄、体重250-300g、性成熟的Wistar大鼠,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供,并在SPF级动物饲养室进行饲养（室温22±2℃;湿度55±5℃;保持12小时昼夜循环）。按雌雄5:1比例午夜合笼,并于次日清晨阴道涂片,显微镜下观察,发现精子者定为妊娠第0天（Gestational day 0,GD0）。孕鼠随机等比分入ETU致畸组（ARMs组）和正常对照组（正常组）。ARMs组于GD10予生理盐水配制、最终质量浓度为1%的ETU 12.5ml/kg灌胃给药;正常组则予生理盐水12.5ml/kg灌胃处理。灌胃后继续饲养,GD14、GD15、GD16时剖宫取胎。其中一部分胚胎4%多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋,4μm厚度切片后用于免疫组化、荧光标记TUNEL染色、原位杂交;另一部分胚胎于无菌条件下取后肠组织并迅速置于液氮中保存,用于后续的RT-qPCR、Western Blotting等实验。2、芯片筛选正常和ARMs胎鼠后肠组织中差异表达的miRNA。基于miRBase数据库设计miRNA芯片,取正常组和ARMs组GD14-GD16后肠组织,进行miRNA芯片检测（广东锐博生物技术有限公司）。在筛查出差异miRNA后,选择差异倍数较大者进行靶基因预测,而后基于靶基因进行GO、KEGG功能富集分析以了解这些miRNA可能具有的生物学功能和可能参与的信号通路,并构建miRNA-靶基因、miRNA-靶基因-信号通路网络图。RT-qPCR对重要的miRNA进行验证。3、miR-92a-2-5p与PRKCA靶向关系的确认,以及二者在正常和ARMs胎鼠后肠组织中的时空表达情况。在通过TargetScan预测PRKCA上miR-92a-2-5p的结合位点后,我们设计并构建了双萤光素酶报告质粒,该质粒包含海肾萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因、未突变结合位点的PRKCA 3’-UTR（野生型）或突变了结合位点的PRKCA 3’-UTR（突变型）,将该质粒与miR-92a-2-5p模拟物或阴性对照共转染后,检测海肾萤光素酶和萤火虫萤光素酶的活性变化情况,以此来确认miR-92a-2-5p与PRKCA是否存在直接靶向关系。对于miR-92a-2-5p在正常和ARMs组织的时空表达情况,我们采用了荧光原位杂交实验;而对于其靶基因PRKCA,则使用Western Blotting检测蛋白表达量、IHC检测PRKCA阳性细胞分布。4、miR-92a-2-5p对靶基因PRKCA及下游效应分子β-catenin表达量的影响。使用大鼠肠上皮细胞进行实验。在过表达或敲降miR-92a-2-5p后,RT-qPCR检测转染效率并确定最佳转染浓度;针对PRKCA设计3个siRNA,转染细胞后RT-qPCR检测转染效率,选择沉默效果最佳的siRNA进行后续实验。在过表达miR-92a-2-5p或沉默PRKCA后,Western Blotting检测PRKCA、β-catenin蛋白表达水平。5、miR-92a-2-5p、PRKCA对大鼠肠上皮细胞功能的作用。过表达miR-92a-2-5p或敲降PRKCA后,检测细胞周期、细胞增殖、caspase 3/7相关凋亡,并使用流式细胞术了解早/晚期凋亡细胞比例的变化。石蜡切片进行TUNEL染色了解正常和ARMs胎鼠后肠组织中凋亡信号的强弱及空间分布情况。6、统计分析。实验数据用均值±标准差表示,使用SPSS 21.0软件（IBM SPSS,美国）进行统计学分析。对于两组之间的比较,使用Student’s t检验（双尾）检验;对于多组之间的比较,使用one-way ANOVA和Tukey post-hoc分析方法。P<0.05时认为统计学差异显著。结果:1、以log₂（Fold change）绝对值>1且P值<0.05为筛选芯片差异miRNA的标准,结果显示:相对于正常组,ARMs组在GD14有38个miRNA上调;GD15有32个miRNA上调,17个下调;GD16有42个miRNA上调。选择|log₂（FC）|>4.25且与肛门直肠畸形相关信号通路有潜在联系的miRNA进行RT-qPCR验证,发现miR-125-2-3p、miR-92a-2-5p、miR-99a-5p在组间差异表达,其中miR-92a-2-5p在miRNA-靶基因-信号通路网络中与靶基因、信号通路联系最为广泛。2、双萤光素酶实验中,共转染PRKCA 3’-UTR野生型质粒与miR-92a-2-5p mimics后,海肾/萤火虫萤光素酶活性明显下降（P<0.05）。miR-92a-2-5p荧光原位杂交结果显示,miR-92a-2-5p在ARMs组中表达水平较高,且主要分布在后肠末端、泄殖腔膜。免疫组化和Western Blotting结果显示PRKCA在ARMs中表达下调。3、过表达miR-92a-2-5p或敲降PRKCA后,PRKCA蛋白表达水平下降,而β-catenin表达水平上升。细胞免疫荧光结果显示,过表达miR-92a-2-5p或沉默PRKCA可引起β-catenin亚细胞定位改变,使其在细胞核内聚集。4、过表达miR-92a-2-5p后细胞死亡增多,且具有剂量依赖性,miR-92a-2-5p浓度越高,细胞死亡越显著。石蜡切片荧光标记TUNEL实验结果显示,ARMs胎鼠后肠组织中凋亡信号增强,且凋亡细胞分布区域与荧光原位杂交结果中miR-92a-2-5p荧光信号分布区域相似。5、过表达miR-92a-2-5p后可引起大鼠肠上皮细胞G1/S期阻滞、增殖减弱、凋亡增多,凋亡以晚期凋亡为主,早期凋亡比例也有少许增加;沉默PRKCA后也出现相似的结果。结论:1、芯片结果提示正常和ARMs胎鼠后肠组织中存在较多差异miRNA,且以上调为主,这些miRNA与发育相关信号通路有潜在联系,其中miR-92a-2-5p呈现出与靶基因及ARMs有关的信号通路最为广泛的关联,提示miR-92a-2-5p可能是影响ARMs相对关键的miRNA。2、miR-92a-2-5p可直接靶向PRKCA,二者在正常和ARMs后肠中趋势相反。过表达miR-92a-2-5p或敲降PRKCA可导致PRKCA表达量下降、下游β-catenin上调,提示miR-92a-2-5p/PRKCA/β-catenin信号轴可能是miR-92a-2-5p发挥生物学功能的途径。3、miR-92a-2-5p在ARMs中表达升高,且主要分布在后肠末端和泄殖腔膜,TUNEL信号分布与此相似;过表达miR-92a-2-5p或沉默PRKCA后,大鼠肠上皮细胞死亡增多,功能试验显示细胞增殖减弱而凋亡增加,提示miR-92a-2-5p可介导PRKCA引起肠上皮细胞增殖抑制、凋亡增加,进而导致ARMs表型出现。