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萝卜蚜Lipaphis erysimi(Kaltenbach)是危害十字花科蔬菜的重要害虫,不仅直接危害蔬菜,还能传播病毒病,对农业生产造成一定的损失。萝卜蚜营孤雌生殖和两性生殖,存在无翅型和有翅型两种表型。本研究以萝卜蚜为研究对象,构建了萝卜蚜转录组Unigene数据库,鉴定出不同发育时期稳定表达的内参基因,并利用hunchback基因构建了萝卜蚜RNA干扰体系,通过RNA干扰的方式鉴定了组蛋白乙酰转移酶Elp3和p300/CBP基因的功能,获得了致死效果较好的RNAi靶标基因。主要结论如下: 1. 萝卜蚜转录组Unigene数据库的构建和实时定量PCR内参基因的鉴定 萝卜蚜L. erysimi为非模式昆虫,其基因组信息的缺乏限制了对其各种生理生化过程分子机制的研究。通过 Illumina 测序平台获得萝卜蚜转录本,共得到107,992,806条的Cleaning Reads,组装得到69,588条Unigene序列,平均长度为716bp。NR注释显示,20,734个转录本可以注释出明确的生物学功能,注释率为29.8%。COG分类显示,13,422个序列被匹配为25个不同的生物学过程。KEGG注释显示,8,149个Unigene序列被分配到31条不同的途径中。RT-PCR验证了6个候选内参基因(ACT、EF1γ、αACT、TBP、SDH、eIF)的序列,qRT-PCR分析了这6个候选内参基因在不同龄期的表达,发现eIF是最稳定的内参基因,可以作为萝卜蚜不同发育时期的有效内参。转录组数据库的构建和有效内参基因的筛选为后续萝卜蚜致死基因的鉴定和翅型分化的研究提供了有效数据平台。 2. 萝卜蚜间隔基因hunchback的功能及其RNAi研究 在豌豆蚜中间隔基因hunchback是一个良好的 RNAi 靶标基因,因此,我们选择利用 hunchback 基因构建基于饲喂萝卜蚜 dsRNA 的 RNA 干扰体系。hunchback基因是昆虫前后轴中的关键调节因子,也是腹部伸长分节发育所必须的调控基因;本研究以萝卜蚜转录组为背景,克隆获得萝卜蚜hunchback基因片段,通过半定量分析了 hunchback 基因在不同龄期的表达量,利用饲喂 dsRNA的方式对萝卜蚜进行RNA干扰,使用qRT-PCR分析了基因的mRNA相对水平的变化情况。研究发现,与GFP相比,饲喂2龄萝卜蚜dsRNA 72h后,通过qRT-PCR 检测 hunchback-1, hunchback-2 的 mRNA 相对水平,分别下降了 54.6%和62.7%, 被RNA干扰7天后的萝卜蚜的累计死亡率分别是52%和64%,没有观察到其他形态发育方面的变化。 3. 萝卜蚜组蛋白乙酰转移酶Elp3和p300/CBP基因的功能及其RNAi研究 在已有的工作基础上发现,无翅萝卜蚜的组蛋白乙酰化程度高于有翅蚜,基于这种差异,我们筛选出Elp3和p300/CBP基因。Elp3和p300/CBP都是重要的组蛋白乙酰转移酶,在昆虫的生殖和发育中起到至关重要的作用。本实验以萝卜蚜转录组为背景,筛选并克隆获得萝卜蚜Elp3和p300/CBP基因片段,通过半定量分析了Elp3和p300/CBP基因在不同龄期的表达量,利用饲喂dsRNA的方式对萝卜蚜进行RNA干扰,使用qRT-PCR分析了基因的mRNA相对水平的变化情况。研究发现,与GFP相比,饲喂2龄萝卜蚜dsRNA 72h后,通过qRT-PCR检测Elp3-1, Elp3-2, p300-1和p300-2的mRNA相对水平,分别下降了41.8%、34%、27.4%和20.4%,被RNA干扰7天后的萝卜蚜的累计死亡率分别是59%、66%、63%和60%;其中Elp3基因被RNA干扰后,萝卜蚜发育缓慢,较GFP晚1.82-2.27天。