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目的炎症因子IL-1β是终末期肾脏病患者(end-stage renal disease,ESRD)发生血管钙化的重要标记分子和调节因子,其可能也参与了血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)早衰的过程。本研究是为了探究炎症因子IL-1β通过诱导VSMCs的早衰促进其向成骨细胞分化从而引起血管钙化的发生,为血管钙化的防御和治疗提供理论依据以及新的药物治疗靶点。方法1.组织水平的研究利用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测ESRD患者血管组织以及正常血管组织切片中衰老相关蛋白P21和成骨细胞标记分子骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP2)的表达水平;利用茜素红染色的方法观察血管钙化情况;通过收集对应组织标本的临床以及影像资料,探究血管衰老与转分化以及血管钙化之间的关联性。2.细胞水平的研究用人脐动脉通过原代培养技术培养出VCMCs作为研究对象,加入10ng/ml重组人IL-1β或(和)3.8m M甘油磷酸钠对同一批细胞进行不同时间点的处理,观察各组细胞形态变化情况,并且对处理的细胞进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色,茜素红染色以及微板法检测细胞内钙离子浓度,从而探究VSMCs的衰老与钙化之间的关系。3.分子水平的研究(1)为了研究炎症因子IL-1β是否通过活化VSMCs的IL-1β/NF-κB/p53/p21,信号通路促进细胞衰老,利用Western blot(WB)检测信号分子P65,P53,P21等的变化;(2)为了研究炎症因子IL-1β诱导VSMCs衰老促进其向成骨细胞发生转分化,利用WB技术检测VSMCs标记分子平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle-actin,α-SMA),成骨细胞标记分子BMP2,Runt相关转录因子-2(Runt-related transcription factor-2,RUNX2)等的表达水平。结果1.IHC结果表明15例ESRD患者桡动脉组织切片中有11例(73.33%)切片其动脉中膜层即平滑肌层衰老相关蛋白P21,成骨细胞标记分子BMP2以及钙化染色均为阳性。提示在ESRD患者中,VSMCs的衰老及其向成骨细胞转化和发生钙化具有相关性。2.炎症因子IL-1β能够诱导VSMCs发生衰老。(1)与对照组相比,在加入高浓度磷和炎症因子IL-1β组中VSMCs随着处理时间的延长,VSMCs的形态从成纤维样细胞逐渐展开平铺于培养皿中,呈现出衰老的形态;(2)较对照组而言,在加入高浓度磷和炎症因子IL-1β组中VSMCs随着处理时间的增加,利用衰老细胞β-半乳糖苷酶染色后发现衰老的细胞增多;(3)通过对不同组衰老相关蛋白P21表达水平的检测发现:与对照组相比,加入高浓度磷和炎症因子IL-1β组的P21的表达水平持续升高。3.WB结果证实炎症因子IL-1β其处理VSMCs,VSMCs中phospho-P65(p-P65),acetylated-P65(Ac-P65),acetylated-P53(Ac-P53)等信号分子明显增加,P53和P21的蛋白表达水平显著升高。证实炎症因子IL-1β活化NF-κB/P53/P21信号通路诱导VSMCs发生衰老。4.茜素红染色以及微板法检测细胞内钙离子浓度提示加入炎症因子IL-1β组的VSMCs发生钙化的程度较对照组加深。而在IL-1β组中加入衰老抑制剂即白藜芦醇后钙化程度与对照组相比未见明显改变。由此推断炎症因子IL-1β能够促进VSMCs发生钙化。5.WB结果证实:与对照组相比,加入炎症因子IL-1β组的成骨细胞标记分子BMP2以及RUNX2的表达水平升高,与衰老相关蛋白P21表达水平相一致。在加入炎症因子IL-1β和白藜芦醇组中,P21,BMP2以及RUNX2的表达水平较对照组未见明显改变。由此说明炎症因子IL-1β促进VSMCs发生钙化需要通过衰老诱导VSMCs向成骨细胞分化。结论1.炎症因子IL-1β可以作为ESRD患者合并血管钙化的生物标志物以及钙化风险的预测因子。2.较高浓度的IL-1β可以通过激活NF-κB/P53/P21信号通路诱导VSMCs发生衰老,促进衰老的VSMCs向成骨细胞转化从而导致血管钙化的发生。3.白藜芦醇可能有助于延缓VSMCs的衰老,在一定程度上减少VSMCs向成骨细胞分化从而降低血管钙化的发生。