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生物活性多肽,也称功能肽。迄今,在人体中已发现了100多种生物活性多肽,这些多肽具有传递生理信息和调节生理功能的作用,对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要。几乎所有疾病的发生、发展、治疗和康复都与多肽有关系。为了开展功能性多肽的研究,建立一种大量表达、快速分离多肽的方法十分必要。为此,我们采取融合表达的策略,在大肠杆菌中分别表达纯化了人阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)相关淀粉样肽(amyloid beta peptide,Aβ)及家蚕抗菌肽moricin,并对获得的Aβ肽和家蚕抗菌肽moricin分别进行了生化分析和抗菌测定。
Aβ肽的异常积聚是AD的主要病理特征之一。目前,已在AD病人脑内检测到一系列不同长度的Aβ肽,其长度35-46个残基不等。我们将Aβ基因融合于Pet-32M载体中,在大肠杆菌中表达一系列包含长度不等Aβ肽的融合蛋白。融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,再经过凝血酶(thrombin)酶切获得不同长度的小肽:Aβ1-46,Aβ1-44,Aβ1-42,Aβ1-40,Aβ1-35,Aβ1-32,Aβ1-28和Aβ29-46等。应用硫磺素T(Thioflavin T,ThT)荧光检测方法比较分析了它们在体外的积聚能力。另一方面,我们构建了Aβ-GFP的表达载体,在大肠杆菌中表达。由于Aβ的积聚会影响GFP的荧光发生,通过观察GFP荧光的强弱可以比较Aβ在大肠杆菌细胞内的积聚情况。实验结果显示Aβ1-46,Aβ1-44和Aβ1-42积聚较快,基本没有延滞期;Aβ1-40和Aβ1-35虽然也能够积聚,但速度较慢,存在较长的延滞期;而 Aβ1-32,Aβ1-28和Aβ29-46没有检测到积聚现象。这些结果表明,C-端氨基酸残基的存在有利于寡聚体积聚核的形成,加速了Aβ肽的积聚过程;淀粉样肽前体APP在细胞膜内的酶切位点影响产物Aβ肽的积聚能力,这也是Aβ1-42的积聚速率和细胞毒性大于Aβ1-40的原因之一。
Moricin是家蚕中发现的一种抗菌肽,对革兰氏阴性和阳性菌都有较强的抗菌活性,具有良好的开发应用价值。为了建立一种大量表达和快速分离Moricin的方法,我们采用PCR拼接法获得moricin基因后重组到表达载体Pet-32M上,在E.coli 中融合表达。表达产物溶解性很好,经Ni-NTA纯化获得融合蛋白,再经凝血酶酶切获得较高纯度的moricin,液相测定法表明纯化获得的moricin具有较强的抗菌活性。