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MAPK7基因对骨肉瘤细胞增殖和转移的功能研究目的:骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,也是儿童和青少年中的高发恶性肿瘤之一。生长迅速和易转移是骨肉瘤的常见特征,因而造成其居高不下的病死率。因此进一步探索骨肉瘤癌细胞增殖和侵袭相关分子生物学机制,是下一代分子靶向抗癌治疗的急切需要。染色体中17p11.2区域的异常扩增是许多临床骨肉瘤的遗传学特征,对这一区域的进一步研究提示了若干潜在的肿瘤生成基因包括PMP22,TOP3A和MAPK7等。PMP22和TOP3A已有报道可调控骨肉瘤细胞增生,而对于MAPK7基因,已有临床观察指出其可能作为潜在的肿瘤预后标记物。但对于其具体的促肿瘤细胞增殖和转移的作用尚无详细描述。本文将以骨肉瘤细胞系SOSP-M为体外模型,通过过表达和基因静默的手段,特异性上调或下调细胞内MAPK7基因表达水平,并运用MTT法,划痕实验法和Matrigel法检测肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,另外利用流式细胞术分析MAPK7基因对细胞凋亡和细胞周期的影响。方法:1、培养骨肉瘤细胞系SOSP-M细胞,对细胞中的MAPK7基因进行过表达和敲低,以此作为体外模型,在细胞水平检测MAPK7基因水平的改变在肿瘤增殖、迁移和侵袭中的作用。2、MAPK7基因的敲低和过表达:订制PCDNA-MAPK7质粒(1微克每毫升)和siRNA-MAPK7(1微克每毫升),利用PCDNA-MAPK7质粒转染骨髓瘤细胞系SOSPM细胞以使细胞中MAPK7基因过表达,过表达采用空质粒组做对照;利用siRNAMAPK7转染骨髓瘤细胞系SOSP-M细胞以敲低细胞中的MAPK7基因,干扰采用Scramble SiRNA做对照,。转染的试剂为Lipofectamine2000TM试剂,以脂质体进行瞬时转染。3、Western blot分析检测MAPK7蛋白表达水平:将培养的SOSP-M细胞随机分为五组:空白组:无转染处理,过表达对照组:转染空白质粒,过表达组:转染PCDNA-MAPK7质粒,敲低对照组:转染Scramble SiRNA,转染敲低组:转染siRNA-mapk7。转染24h后收集细胞,提取细胞的总蛋白,利用westernblot分析,以gapdh为内参,检测各组中mapk7蛋白表达水平的差异。4、mapk7基因的表达水平检测:将培养的sosp-m细胞随机分为五组:空白组:无转染处理,过表达对照组:转染空白质粒,过表达组:转染pcdna-mapk7质粒,敲低对照组:转染scramblesirna,转染敲低组:转染sirna-mapk7。转染24h后收集细胞,提取细胞的总rna,反转录为cdna,然后利用mapk7基因上下游引物进行realtimepcr分析,以gapdh为内参,检测各组细胞中目的基因mapk7mrna表达水平变化。5、细胞增殖水平观察:将转染后的五组细胞传入96孔板,利用mtt法,记录在酶联免疫监测仪570nm波长处各孔的吸光度值,生长曲线的绘制横轴为时间,纵轴为吸光度值,在坐标轴内描出各个点的位置,连成过原点的直线,根据此坐标轴计算生长抑制率,检测转染24h后各组中细胞的增殖情况。6、细胞迁移能力观察:将转染后的五组细胞传入6孔板,利用细胞划痕实验,观察划痕24h后,每组随机选取8个视野,计算细胞迁移比率,比较各组的细胞迁移能力。7、细胞侵袭能力观察:将转染后的五组细胞传至包被好基底膜的transwell小室中,对细胞进行培养,培养48h后,洗掉膜上的细胞,染色30min,计数每个100x视野内细胞数,比较各组之间细胞侵袭情况。8、细胞凋亡和细胞周期的检测:应用流式细胞仪技术检测细胞凋亡和细胞周期,分析细胞的凋亡情况和细胞周期进程,以及利用realtimepcr技术和westernblot技术分析上皮细胞间质化,即emt过程中标志分子的表达量变化。9、统计学处理:用单样本ks检验正态分布检验处理所有收集的资料。采用卡方检验或秩和检验处理计数资料。测量数据由studentt检验(两个组)或方差分析(anova,超过三组)进行统计分析。然后通过事后tukey检验进行进一步组间比较。当p<0.05,差异具有统计学意义。结果:1、mapk7表达水平分析real-timepcr和westernblot分析结果均显示,分别与对照组相比较,转染pcdna-mapk7质粒的肿瘤细胞中mapk7基因表达水平明显提高,而转染了sirna-mapk7的肿瘤细胞中mapk7基因表达水平明显降低。表明订制的pcdna-mapk7质粒和sirna-mapk7确实能够提高和敲低细胞中mapk7基因的水平。2、细胞增殖水平观察mtt法检测细胞增殖结果显示,与空白组相比较,转染了空白质粒的对照组无明显区别。可见空白质粒转染对sosp-m细胞增殖没有影响。但转染pcdna-mapk7质粒后可见肿瘤细胞增殖显著提高,约为空白组的1.79倍。与scramblesirna组比较,sirna-mapk7转染可以显著抑制细胞增殖,只有scramblesirna组的51.8%。结果表明mapk7基因在促进肿瘤细胞增殖方面有重要作用。3、mapk7基因对细胞迁移影响在划痕实验中发现,在pcdna-mapk7转染的细胞中,出现了较多的细胞迁移,而上述现象在sirna-mapk7转染组中迁移细胞数明显减少。结果表明,mapk7基因在肿瘤细胞的迁移过程中发挥作用。4、细胞侵袭实验matrigel侵袭实验显示,mapk7过表达显著增进骨肉瘤细胞的侵袭数目,每个100x视野内12.6个细胞,而sirna抑制则可以显著降低侵袭细胞数目,每个100x视野内2.1个细胞。5、mapk7能够抑制骨肉瘤细胞凋亡为了检测mapk7表达水平的改变对骨肉瘤sosp-m细胞凋亡的影响,我们利用流式细胞仪分析检测过表达和干扰mapk7后细胞发生凋亡的变化。过表达mapk7后显著抑制了细胞凋亡的发生,sosp-m细胞的凋亡细胞数与过表达对照组相比下降了约30%;而转染mapk7sirna敲降mapk7后明显促进了细胞凋亡的发生,sosp-m细胞的凋亡细胞数与scramblesirna组相比升高了约2.1倍。差异具有统计学意义(*p<0.05)6、mapk7能够促进骨肉瘤细胞的细胞周期在证实了mapk7能够促进骨肉瘤细胞sosp-m的细胞增殖的基础上,为了研究其调控细胞增殖的作用机制,我们进一步研究了mapk7是否参与了细胞周期的调控过程。为了检测mapk7表达水平的改变对骨肉瘤sosp-m细胞周期的影响,我们利用流式细胞仪分析检测过表达和干扰MAPK7后细胞周期的变化。在SOSP-M细胞中,与过表达对照组相比过表达MAPK7后,G1期的细胞比例由59.4%减少到37.5%,S期比例由21%升高到34.5%。而转染MAPK7 siRNA干扰MAPK7的表达后明显抑制了细胞周期的进程。也就是说,siRNA-MAPK7干扰MAPK7的表达后使较多的细胞累积在G1期,而无法顺利进入S期。因此,我们认为MAPK7影响了骨肉瘤细胞SOSP-M从G1期进入S期,从而作用于细胞周期进程(*p<0.05)结论:1、MAPK7基因可以促进骨肉瘤的增殖。2、MAPK7基因可以促进骨肉瘤的迁移。3、MAPK7基因可以促进骨肉瘤的侵袭。4、MAPK7能够抑制骨肉瘤细胞凋亡。5、MAPK7能够促进骨肉瘤细胞的细胞周期。