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表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中含量最高的单体化合物,占50%-60%。在体外和动物模型上EGCG都显现出令人关注的药理特性,如抗氧化,抗肿瘤,抗炎,降血脂,防辐射,抗衰老以及改善肝功能等生物活性。但是EGCG的体内药代动力学表明,其体内生物利用度较低,口服吸收较差。目前EGCG在体内吸收转运的方式和机制并不十分清楚。Caco-2细胞是最常用的体外吸收模型之一,是阐明药物吸收机制的有力工具。Caco-2细胞来源于人结肠癌上皮细胞,体外培养条件下,能分化形成致密的细胞单层,与小肠上皮结构和生化作用相似,具有微绒毛结构,能表达多种蛋白载体和酶,近年来被广泛用于药物摄取、外排及跨膜转运等药物经肠道吸收机制的研究。本研究采用Caco-2细胞单层模型研究EGCG的转运机制,EGCG在Caco-2细胞单层模型的双向转运特征,以探讨EGCG口服生物利用度低的分子机制,为找到提高EGCG生物利用度的方法,增加EGCG在血浆和组织中的含量从而提高EGCG体内生理活性打下基础。1.Caco-2细胞体外跨膜转运模型的建立与评价Caco-2细胞按3×105个/cm2的密度接种在嵌入式的培养皿上,培养21天后测得细胞单层模型的TEER值为378±33Ω.cm2,并且在电镜下可见明显的细胞单层微绒毛和细胞单层的紧密连接,阳性标记物华法林和阴性标记物荧光黄的表观渗透系数分别为1.98×10-5cm/s和5.1×10-cm/s。以上结果均提示细胞培养21天后,已经形成致密的细胞单层。为了评价Caco-2细胞单层模型的功能特性,所以在实验中考察了维拉帕米(P-糖蛋白的抑制剂)在Caco-2细胞单层上对罗丹明-123(P-糖蛋白的底物)转运的影响和已知体内吸收率的系列参考化合物在Caco-2细胞上表观渗透系数与在人体内的吸收之间的相关性。结果表明,维拉帕米能显著促进罗丹明-123从AP侧到BL侧的转运,提示在Caco-2细胞单层的AP面上表达了P-糖蛋白,并介导物质的转运。另外,系列参考化合物在Caco-2细胞上表观渗透系数与在人体内的吸收率的相关系数为0.806(P=0.003),表明两者之间具有良好的相关性,所以Caco-2细胞模型在一定程度上适合用于预测药物在人体内的吸收。2. EGCG在Caco-2细胞单层模型上的摄取和转运EGCG在Caco-2细胞中的摄取在50-200μg/ml浓度范围内具有显著的浓度依赖性,并且EGCG从Caco-2细胞单层模AP面到BL面的通透量在100-400μg/mL浓度范围内呈线性增加(r2=0.9907),表明EGCG在Caco-2细胞单层模型上可能通过被运扩散的方式进行转运,并且EGCG从AP侧到BL侧的Papp均小于10-6 cm/sec,表明EGCG属于吸收较差的药物。3. EGCG与P-糖蛋白和MRP2的作用关系为了探讨EGCG在Caco-2细胞上吸收差的分子机制,实验中我们考察了P-糖蛋白的抑制剂维拉帕米和环孢素A以及MRP2的抑制剂MK-571对EGCG在细胞单层模型上转运的影响,结果表明维拉帕米和环孢素A能够增加EGCG在Caco-2细胞上的摄取,并增加EGCG在Caco-2细胞单层模型上从AP侧到BL侧的Papp,降低从BL侧到AP侧的Papp。MK-571也具有类似的效果,并且作用效果更加显著,提示EGCG应是P-糖蛋白和MRP2的共同底物。另一方面,我们还考察了EGCG对P-糖蛋白的底物罗丹明-123从AP侧到BL侧转运的影响,结果表明EGCG能促进罗丹明-123在Caco-2细胞单层模型上的转运,表明EGCG可能对P-糖蛋白有抑制作用。