论文部分内容阅读
由角膜病引发的角膜混浊是致盲的重要原因之一。Mycn是Myc原癌基因家族的一员,主要参与细胞增殖、凋亡、分化等多种细胞过程。国内外对Mycn基因的研究重点围绕肿瘤的发生。在先前的研究中,本实验室使用化学诱变剂乙烷基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠突变获得一例Mycn基因点突变角膜混浊小鼠模型。随后从美国杰克逊实验室引入MycntmlPsk/J(Mycnflox/+)鼠以及广泛表达Cre重组酶的EIIa-Cre工具鼠,进一步确定了Mycn基因突变与角膜混浊的相关性。研究发现部分角膜混浊小鼠在初生时呈眼睑开放表型,故将角膜混浊小鼠分为初生时眼睑闭合型及开放型两种,并已对眼睑开放型角膜病的发生原因进行研究。本研究主要目的是确定Mycn基因上皮特异性敲除是否也可以获得类似的角膜病表型并进一步对其中眼睑闭合型角膜病的发生机制进行初探。1.Mycn基因上皮特异性敲除角膜病小鼠的获得将从美国杰克逊实验室引入的Mycntm1Psk/J(Mycnflox/+小鼠以及皮肤特异性表达Cre重组酶的K14-Cre工具鼠两种小鼠配种,最终获得上皮特异性Mycn基因敲除小鼠(Mycn-/+),该小鼠出生后表现为角膜混浊表型。部分角膜混浊小鼠在初生时呈眼睑开放表型,故本文研究的Mycn-/+角膜混浊小鼠也可分为初生时眼睑闭合型及开放型两种类型。2.Mycn-/+小鼠角膜病理组织学观察对3周(3W)小鼠眼球HE染色发现:(1)眼睑闭合型Mycn-/+角膜病小鼠角膜上皮细胞出现空泡,角膜内皮细胞部分缺失,且其缺失下方晶状体变性;(2)眼睑开放型Mycn-+小鼠角膜上皮局部增厚,角膜基质层可见明显新生血管。采用免疫组织化学技术对3W小鼠角膜上皮细胞角蛋白keratin 12(K12)、keratin 14(K14)、keratin 10(K10)的表达情况进行检测。结果发现:(1)对照组小鼠角膜上皮所有细胞K12组化呈阳性;基底层少许细胞K14呈弱阳性;K10呈阴性;(2)眼睑闭合型Mycn-/+小鼠角膜上皮细胞K12表达呈阳性,但局部信号减弱;角膜上皮细胞层K14表达呈强阳性;K10表达呈阴性;(3)眼睑开放型Mycn-/+小鼠角膜增厚区K12呈阴性;K14表达呈阳性,但增厚区信号减弱;增厚区局部上皮表层细胞K10表达呈阳性。对3W小鼠角膜上皮整合素beta4亚单位(Integrin beta4)组化结果发现正常小鼠整合素beta4阳性细胞仅在角膜上皮基底层分布;眼睑闭合型Mycn-/+小鼠整合素beta4表达于整个细胞层并且信号增强;眼睑开放型Mycn-/+小鼠beta4表达呈阳性但在增厚区较弱。3.Mycn-/+小鼠晶状体泡分离缺陷及其机制的初探为确定闭合型角膜病变发生是否与胚胎期晶状体泡与表面外胚层分离缺陷有关,分别对胚胎期11、12及13天(E11-13)左右小鼠眼区进行组织学观察,结果证实Mycn基因敲除可引起小鼠胚胎期晶状体泡分离缺陷,是引起闭合型角膜病变的主要原因。进一步研究发现Mycn基因敲除可引起E-cadherin表达上调,是导致晶状体泡与表面外胚层分离障碍的可能原因。结论:本研究发现Mycn上皮特异性敲除同样可以导致小鼠角膜病的发生,其中闭合型角膜病的发生与该小鼠胚胎期晶状体泡的分离缺陷有关,并对其机制进行初探。本研究丰富了Mycn细胞生物学功能并为人类部分遗传性角膜病发生及其机制的研究提供参考。