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肝功能衰竭是影响人类健康的常见疾病。肝移植是唯一能根除终末期肝病的有效方法，三年生存率达70％～80％，但移植技术、围手术期管理要求高，移植后可能发生并发症，术后必需长期免疫抑制剂治疗，更为不足的是肝源短缺，使肝移植惠及人群有限。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem Cells，BMSCs)是来源于骨髓的一类具有贴壁生长特性并具备多向分化潜能和自我更新能力的细胞，在一定条件下可分化为特定组织类型细胞，包括肝细胞，是治疗肝衰竭的理想种子细胞。活体状态下动态监测植入体内BMSCs的存活、迁移乃至分化是BMSCs移植治疗推广至临床必须解决的一个重要问题。分子影像学的发展使活体监测移植干细胞的归巢及功能成为可能。目前用于干细胞活体示踪的分子影像学技术主要包括光学成像、磁共振成像和核素显像，各有优缺点，因此，联合多种影像可以取长补短，充分发挥分子影像学的作用，目前已取得一定成果。细胞的活体监测离不开细胞标记，超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是干细胞MR显像的一种常用对比剂。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记是光学成像的常用标记基因。细胞标记是否影响干细胞的多向分化能力特别是向目标细胞分化的能力是再生医学必需关注的问题，目前尚未见系统全面介绍GFP和/或SPIO标记对干细胞成肝分化能力影响的报道。
研究目的：
实现骨髓间充质干细胞成骨、成脂和成肝多向分化诱导。通过对SPIO标记、增强型GFP标记和SPIO/GFP双标记干细胞进行成骨、成脂和成肝分化诱导，比较四种细胞诱导分化效果，探讨SPIO标记、增强型GFP标记和SPIO/GFP双标记对于细胞成骨、成脂和成肝分化能力的影响作用，并为课题组后续实验提供基础。
研究方法：
1、大鼠骨髓间充质干细胞的获取和鉴定
采用密度梯度离心法和贴壁法获取大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)，采用三代后BMSCs，苔盼蓝染色测细胞活力，茜素红染色检测细胞成骨分化能力；油红O染色验证细胞成脂分化能力。
2、大鼠骨髓间充质干细胞高效分化成具备一定肝功能的肝细胞
用Matrigel包被培养皿，以21.5×103/CM2的密度种植BMSCs，在含有肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子—4、表皮生长因子、ITS+1、地塞米松、维生素C、胎牛血清等的诱导培养基中进行细胞培养，每三天换液一次。对诱导培养细胞分别从细胞形态、基因水平、生化水平等进行鉴定。鉴定方法包括光学显微镜观察形态学变化，RT—PCR检测骨髓干细胞标记(骨髓间质细胞抗原1，BST-1)，肝细胞早期(M2型丙酮酸激酶，M2-PK；甲胎蛋白，AFP)和晚期标记(白蛋白，ALB)基因变化，细胞免疫化学染色测AFP、ALB，放免法测上清液白蛋白浓度，生化分析测上清液尿素氮(BUN)浓度，糖原染色测诱导细胞糖原合成和储存功能。
3、SPIO、EGFP和SPIO/GFP双标记对MSC成骨、成脂和成肝分化能力的影响
用带EGFP基因的慢病毒感染干细胞96小时，病毒感染指数(multiplicity of infection，MOI)为20，荧光显微镜观察干细胞荧光标记率，所得EGFP标记细胞记为GFP—MSC；采用25ug/mL SPIO联合0.75ug/mL多聚赖氨酸(PLL)孵育48小时标记BMSCs和GFP—MSC，所得标记细胞分别记为SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC。分别对MSC、GFP—MSC、SPIO—MSC和SPIO/GFP—MSC进行成骨、成脂、成肝诱导，比较各指标的差异。除成肝分化鉴定采用实时荧光定量PCR检测诱导两周时各组细胞ALB mRNA表达量外，其余方法同第1和第2部分。
研究结果：
1、密度梯度离心法和贴壁法获得的骨髓间充质干细胞活性高(大于98％)，流式细胞仪检测细胞表达CD29(89.82％)和CD44(70.15％)，不表达CD45(3.69％)和CD11b(2.93％)。成骨诱导2-3周茜素红染色见呈橘红色的钙盐沉积；成脂诱导5-9天，油红O染色显示诱导细胞内红染的脂滴。
2、成肝诱导后，MSCs增殖减慢，细胞由长梭型逐渐向类肝细胞形态转变，变为类圆形、三角形、多角形。mRNA水平上，诱导细胞M2-PK、AFP表达先增加后消失，ALB表达逐渐增高，诱导28天BST-1无表达：免疫细胞细胞化学鉴定：诱导5天、8天细胞AFP染色阳性；诱导14天ALB蛋白染色阳性，随时间延长阳性率增加；诱导1周起上清液可检测到BUN和ALB，并有时间依耐性；诱导三周细胞糖原染色即见整个视野呈阳性，四周颜色加深。
3、带EGFP基因的慢病毒感染MSC标记率达98％.普鲁士蓝染色显示25ug/mL SPIO联合0.75ug/mL多聚赖氨酸(PLL)孵育48小时对MSC和GFP—MSC标记率可达100％，三种标记细胞活力大于98％；对SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四种细胞成骨诱导3周后茜素红染色阳性，成脂诱导5-9天后油红O染色阳性；对SPIO—MSC，GFP—MSC，SPIO/GFP—MSC和MSC四种细胞进行成肝诱导，细胞增殖速度减慢，形态学变化相似，诱导两周时实时荧光定量PCR显示ALB mRNA表达差异无统计学意义，诱导8天AFP、诱导14天ALB免疫细胞化学染色结果均见大片胞浆染色阳性表现，上清液白蛋白、BUN浓度均在第7天可检测到，随时间上升，2周后达平台；诱导4周糖原染色均呈大片状红染。
结论：
1、密度梯度离心法和贴壁法是大鼠骨髓间充质干细胞分离的良好手段，获取的干细胞纯度和活性高，具备成骨、成脂分化能力。
2、本实验中，骨髓间充质干细胞被高效诱导成具备白蛋白合成、尿素合成以及糖原合成与储存功能的肝细胞。
3、带EGFP基因的慢病毒可高效标记MSCs，25ug/mL SPIO联合0.75ug/mLPLL孵育48h可高效标记MSC和GFP-MSC。SPIO-MSC、GFP-MSC和SPIO/GFP-MSC均具备成骨、成脂分化能力且不影响其成肝分化能力。