解析神经系统的网络连接,包括输入与输出,是理解脑功能和脑疾病发生机制的基础,而这需要能够逆行和顺行跨突触标记神经元回路的示踪剂。基于嗜神经病毒的跨突触追踪技术是解析脑神经网络最有效的手段之一,因为病毒载体不仅可以用来标记神经网络的结构连接,而且可以表达不同的基因以进行功能操控。理想的病毒示踪剂需要满足两个条件:一是毒性低;二是跨突触效率高。虽然多种减毒的或高效逆行跨单突触的狂犬病毒系统已经被开发,但也存在制备工艺难,跨突触效率受影响等问题。此外,目前还缺乏能够高效顺行跨突触示踪的减毒型工具病毒。为了解决这些缺陷,本文主要围绕减毒型嗜神经工具病毒系统的开发与应用展开工作,主要包括以下3个部分:（1）野生型VSV具有顺向跨多突触传播的特性,但存在毒性大,导致实验动物快速死亡等缺陷。本文通过反向遗传学手段建立了一种VSV复制相关基因N突变的重组病毒VSV-NR7A,并评估它的细胞毒性和跨突触效率。与野生型VSV示踪剂（WT-VSV）相比,VSV-NR7A在细胞水平上的增殖更慢且毒性更低;在活体标记中,VSV-NR7A具有显著减少的神经炎症反应,且感染的小鼠比WT-VSV组具有更长的存活时间;此外,VSV-NR7A具有顺行跨突触的能力,但跨突触效率比WT-VSV慢;重要的是,由于减少的毒性和延长的感染动物的存活时间,VSV-NR7A可以标记更多的下游脑区。这些结果表明VSV-NR7A是一种很有前途的顺行病毒示踪剂,使研究人员能够探索特定大脑区域的更多下游输出网络,并在较长时间窗内观察其解剖结构以及下游环路的功能。（2）在减毒型重组病毒VSV-NR7A的基础上,本文进一步对毒力基因进行突变,构建了VSV病毒复制相关基因和毒力基因突变型重组病毒VSV-NR7A-ΔM51,在BHK-21细胞中成功拯救和制备了带有EGFP报告基因的突变型VSV,并评估它的生物学特性、细胞毒性和跨突触特征。通过在不同温度条件下扩增的一步生长曲线实验,证明了VSV-NR7A-ΔM51属于温度敏感型病毒;同时,与WT-VSV和VSV-NR7A示踪剂相比,突变体VSV-NR7A-ΔM51病毒具有更低的细胞毒性,且能够有效转导体外培养的原代神经细胞,可用于转导目的基因在细胞上进行表达,同时可对感染的哺乳动物细胞进行传代培养;此外,在活体标记中,不管是感染腹侧海马区（v HPC）还是腹侧被盖区（VTA）,突变体VSV-NR7A-ΔM51只感染原位细胞,不能进行跨突触传播感染下游神经网络,且感染7天后,病毒会被清除掉或者随着细胞的死亡而消失,因而不会导致实验动物的死亡。这些结果表明突变体VSV-NR7A-ΔM51可以作为一种原位感染的顺行病毒示踪剂,可用于特定脑区过表达目的基因以研究功能,且在疫苗和溶瘤病毒开发等方面具有潜在的应用价值,但不能作为跨突触示踪剂使用,同时也说明了在病毒改造时要系统评估毒性与跨突触效率之间的平衡。（3）为了解决减毒型狂犬病毒CVS-N2c-ΔG拯救和制备困难的问题,引入了高效拯救和制备SAD-B19-ΔG的工艺系统,建立了高效生产CVS-N2c-ΔG的方法,可以在短时间内制备和SAD-B19-ΔG滴度相当的假型病毒,同时,N2c G包裹的CVS-N2c-ΔG具备高效逆行感染上游神经网络的能力。最后,对CVS-N2c-ΔG病毒的跨突触效率进行评估。通过不同的狂犬病毒系统组合不同来源的狂犬病毒外膜糖蛋白（RVG）建立的多种逆行跨单突触系统,并在小鼠神经系统中比较了它们的跨突触效率,发现o G辅助CVS-N2c-ΔG跨突触效率高于SAD-B19-ΔG/o G系统,为后者的3～4倍,而与CVS-N2c-ΔG/N2c G系统没有差异,说明o G可以辅助CVS-N2c-ΔG高效跨突触,但不能提高CVS-N2c-ΔG本身的跨突触效率,同时也表明CVS-N2c-ΔG/N2c G系统的跨突触效率高于SAD-B19-ΔG/o G系统。此外,经过密码子修饰的N2c G（opti G）不能提高CVS-N2c-ΔG的跨突触效率。因此,利用o G或N2c G辅助CVS-N2c-ΔG逆行跨单突触传播系统可以解析更全面的输入网络。综上所述,本文为神经回路的结构和功能研究,包括输出网络与输入网络,提供了改进的病毒示踪工具,有望在神经科学领域得到广泛的应用。