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随着人们生活方式的变化和周围环境的污染,我国恶性肿瘤的发病率不断升高,已成为第一位的致死疾病。临床上紫杉醇对各种恶性肿瘤均有显著疗效,但它在临床使用过程中表现出一种剂量依赖的神经毒性作用。其中以神经病理性疼痛最为严重,但其作用机制目前尚不明确,同时由于紫杉醇诱发的神经病理性疼痛对目前所使用的镇痛药均不敏感,因此临床上针对这一副作用仍缺乏有效的治疗手段。与此同时,随着对紫杉醇引起神经毒性作用的研究越来越深入,越来越多的研究报道了紫杉醇除能神经病理性疼痛外,其对认知功能也存在一定的损伤。因此对化疗药紫杉醇诱发神经病理性疼痛和认知损伤的深入研究,将揭开化疗药诱发神经毒性的新机制,为临床治疗找到新的治疗靶点。一直以来,众多研究学者认为由于血脑屏障的存在,紫杉醇等化疗药无法进入大脑和损伤中枢神经功能,因此紫杉醇的神经病变只发生在外周感觉神经中。随着正电子发射断层扫描技术的应用,人们在脑中检测到了带有放射性标记的紫杉醇,表明紫杉醇可以透过血脑屏障进入脑组织发挥作用。大脑海马、皮质和纹状体等作为边缘系统的核心区域,在空间学习记忆以及认知过程中发挥着关键作用。在已知的神经病理性疼痛机制中MAPKs信号通路、GABAB受体以及NF-κB信号通路的激活,可促使诱导型一氧化氮合酶（inducible nitic oxide synthase,i NOS）、活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）等氧化应激因子及白介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）等炎性因子的产生,进而诱发疼痛。大脑在受到外来药物刺激时还可发生氧化应激反应,神经元异常放电频率增加,神经元兴奋性增高,谷氨酸释放增加,同时还会诱发多种疼痛介质和炎性因子的释放,导致神经元激活阈值下降和中枢敏化形成,最终形成痛觉过敏和大脑神经细胞凋亡。因此,我们考虑紫杉醇除可引起外周神经痛外还能透过血脑屏障进入脑组织,产生神经毒性作用,引起神经元细胞发生炎性反应和氧化应激反应,并最终导致细胞凋亡的发生。由于海马区域含有丰富的NF-κB表达,因此我们考虑紫杉醇可能也会通过NF-κB/TNF-α信号通路对海马神经元造成伤害,使学习和记忆功能受到损害。因此,本研究先以NF-κB和GABAB受体为切入点,研究紫杉醇诱发神经痛中中枢海马NF-κB通路和GABAB受体的作用以及对炎性因子的调控作用。在此基础上再进一步探究促炎因子TNF-α和细胞凋亡在紫杉醇诱发大脑学习记忆功能损伤中的作用,明确NF-κB信号通路和炎性因子在紫杉醇诱导神经痛和大脑学习记忆功能损伤中的调控作用,这对于阐明紫杉醇诱发神经痛和大脑学习记忆功能损伤的发生机制、开发药物治疗靶点具有重要的理论价值。第一部分紫杉醇诱导海马神经元细胞凋亡过程中NF-κB/TNF-α信号通路表达的变化目的:通过培养原代海马神经元细胞,观察不同浓度紫杉醇对海马神经元细胞凋亡的影响以及NF-κBp65和TNF-α在细胞中的表达情况,探索紫杉醇诱导细胞凋亡中NF-κB和TNF-α表达变化的影响。方法:选取原代培养5d、浓度约为1×106/ml的海马细胞,给予不同浓度（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）紫杉醇,采用MTT法及流式细胞仪分别检测海马细胞抑制率及凋亡率,以确定紫杉醇诱发细胞凋亡的最最适浓度及处理时间,作为蛋白测定的实验条件。另选取原代培养5d的海马细胞随机分为两组:C组:空白对照组,N组:紫杉醇最适浓度处理组。Western blot法测定海马神经元细胞NF-κBp65和TNF-α蛋白表达水平。结果:1.MTT比色法检测细胞抑制率结果:紫杉醇浓度相同、作用时间不同时,随着时间的增长,细胞抑制率逐渐增加（P<0.05）;同样紫杉醇作用时间相同、浓度不同时,随着浓度的增高,细胞的抑制率逐渐升高（P<0.05）;2.流式细胞仪测细胞凋亡结果显示:海马神经元在1μmol/L紫杉醇条件下暴露24h,早期凋亡率达（47.83±5.34）%;而在10μmol/L紫杉醇条件下暴露24h后,早期凋亡率高达（72.49±6.55）%（P<0.05）;3.Western blot法分析结果得出:与C组比较,N组NF-κBp65和TNF-α的蛋白表达明显增高（P<0.05）。结论:紫杉醇可诱导原代海马神经元细胞发生凋亡,此过程具有时间和浓度的交互作用。紫杉醇诱导细胞凋亡的发生伴随着NF-κB和炎性因子TNF-α蛋白表达的上调。第二部分NF-κB/TNF-α信号通路及GABAB受体在紫杉醇诱发神经痛大鼠海马中的表达变化目的:利用核因子-κB（NF-κB）通路抑制剂（SN50）和γ-氨基丁酸B（GABAB）受体激动剂（巴氯芬）,观察紫杉醇对大鼠中枢海马核因子-κB通路和炎性因子及GABAB受体的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠50只,体重160180g,采用腹腔注射紫杉醇的方法制备大鼠紫杉醇诱发神经病理性疼痛模型,取模型制备成功的大鼠40只,采用随机数字表法,根据鞘内给药（共10μl）的不同分为四组（n=10）:紫杉醇对照组（N组）:生理盐水;巴氯芬组（B+N组）:巴氯芬0.5μg;SN50组（SN+N）组:SN50 200ng;SN50+巴氯芬组（SN+B+N）组:SN50 200ng+巴氯芬0.5μg。另取10只同周龄正常大鼠腹腔注射生理盐水并鞘内置管作为正常对照组（C组）,鞘内注射生理盐水10μl。五组大鼠于腹腔给药后第14天（T1）、鞘内给药前（T2）、鞘内给药后120min（T3）分别测定大鼠50%机械缩足阈值（mechanical with-draw threshold,MWT）,然后取大鼠海马组织。应用免疫组织化学染色及Western blot法检测海马GABAB1受体、NF-κB p65及炎性因子（IL-1β、TNF-α）的表达水平。结果:1.机械缩足阈值实验结果:与C组比较,N组、B+N组、SN+N组、SN+B+N组大鼠MWT在T1、T2时点降低（P<0.05）;与N组比较,B+N组、SN+N组及SN+B+N组大鼠MWT在T3时点升高（P<0.05）;与T1时点比较,B+N组、SN+N组及SN+B+N组大鼠MWT在T3时点升高（P<0.05）。2.Western blot分析结果显示:与C组比较,N组大鼠海马GABAB1受体蛋白表达下降,NF-κB p65、炎性因子IL-1β及TNF-α蛋白表达上调（P<0.05）;与N组比较,B+N组、SN+N组及SN+B+N组大鼠海马GABAB1受体蛋白表达上调,而NF-κB p65炎性因子IL-1β及TNF-α蛋白表达下降（P<0.05）。3.免疫组织化学检测结果:与C组比较,N组大鼠GABAB1受体阳性细胞数减少,NF-κB p65及炎性因子IL-1β、TNF-α阳性细胞数明显增多（P<0.05）;与N组比较,B+N组、SN+N组和SN+B+N大鼠GABAB1受体阳性细胞数增多,NF-κB p65及炎性因子IL-1β、TNF-α阳性细胞数明显减少（P<0.05）。结论:紫杉醇诱发痛的发生与海马NF-κB通路及下游炎性因子IL-1β、TNF-α蛋白表达上调、GABAB1受体表达下调有关。NF-κB信号通路的激活受到GABAB受体表达下调的影响。抑制NF-κB及其下游炎性因子的表达、激活GABAB受体可缓解紫杉醇诱发神经痛大鼠的疼痛。第三部分TNF-α对紫杉醇诱发神经痛大鼠学习记忆功能的影响目的:通过给予紫杉醇大鼠TNF-α抑制剂Thalidomide,观察炎性因子TNF-α对紫杉醇诱发神经痛大鼠学习记忆功能的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠48只,采用随机数字表法分成四组,每组12只。紫杉醇组（PTX组）:腹腔注射紫杉醇2mg/kg,隔日一次,连续4次;TNF-α抑制剂组（THD组）:口服Thalidomide 100mg/kg/d,隔日一次,连续4次;TNF-α抑制剂+紫杉醇组（THD+PTX）组:腹腔注射紫杉醇2mg/kg+口服Thalidomide 100mg/kg/d,隔日一次,连续4次。空白对照组（Vehicle组）:腹腔注射等量生理盐水及口服等量的橄榄油。四组大鼠于给药前及给药后的第4d、第8d、第12d、第13d、第14d、第15d进行机械缩足阈值的测定和Morris水迷宫实验,然后取大鼠海马组织。应用Western blotting实验检测大鼠海马炎性因子TNF-α和IL-1β蛋白的表达水平,ELISA试剂盒检测血浆和脑脊液中TNF-α的含量。结果:1.机械缩足阈值的实验结果:PTX组和PTX+THD组大鼠在第14d的MWT与给药前（0 day）相比明显降低（P<0.05）;Vehicle组和THD组大鼠在第14d的MWT与给药前（0 day）相比无明显变化。2.Morris水迷宫实验结果:与对照组（Vehicle组）相比,PTX组大鼠在给药后第8天至第15天逃避潜伏期延长,穿越原平台次数减少（P<0.05）,THD组大鼠逃避潜伏期和穿越原平台次数无明显变化;与PTX组相比,THD+PTX组大鼠在给药后第8天至第15天逃避潜伏期缩短,穿越原平台次数增多（P<0.05）。3.Western blot分析显示:与Vehicle组相比,PTX组TNF-α和IL-1β蛋白表达明显增高（P<0.05）,THD组TNF-α和IL-1β蛋白表达则无变化;与PTX组相比,THD+PTX组TNF-α和IL-1β蛋白表达显著降低（P<0.05）。4.血浆和脑脊液中TNF-α的含量变化:与对照（Vehicle）组相比,紫杉醇（PTX）组大鼠血浆和脑脊液中TNF-α含量均明显增多（P<0.05）,THD组无明显变化;与紫杉醇（PTX）组相比,紫杉醇+Thalidomide（PTX+THD）组血浆和脑脊液中TNF-α含量均显著减少（P<0.05）。结论:紫杉醇引起神经痛的同时还能损伤学习和记忆功能。紫杉醇诱发的学习记忆损伤与海马神经元TNF-α和IL-1β表达的增加有关。给予TNF-α抑制剂Thalidomide治疗后,显著降低炎性因子TNF-α和IL-1β表达,显著改善学习记忆功能。第四部分细胞凋亡在紫杉醇诱发神经痛大鼠学习记忆功能损伤中的作用目的:通过给予紫杉醇大鼠TNF-α抑制剂Thalidomide,观察细胞凋亡相关蛋白caspase-3在紫杉醇诱发神经痛大鼠学习记忆功能损伤中的表达变化。方法:清洁级雄性SD大鼠36只,采用随机数字表法分成三组,每组12只。紫杉醇组（PTX组）:腹腔注射紫杉醇2mg/kg,隔日一次,连续4次;TNF-α抑制剂+紫杉醇组（THD+PTX）组:腹腔注射紫杉醇2mg/kg+口服Thalidomide 100mg/kg/d,隔日一次,连续4次。空白对照组（Vehicle组）:腹腔注射等量生理盐水及口服等量的橄榄油。四组大鼠于给药前及给药后的第4d、第8d、第12d、第13d、第14d、第15d进行机械缩足阈值的测定和Morris水迷宫实验,然后取大鼠大脑皮层和海马组织。应用TUNEL染色观察细胞凋亡情况;Western blotting实验检测cleaved caspase-3和TNF-α蛋白的表达水平;免疫组织化学检测cleaved caspase-3和TNF-α的表达及部位;MDA法检测机体的氧化应激水平。结果:1.机械缩足阈值的实验结果:PTX组和PTX+THD组大鼠在第14d的MWT与给药前（0 day）相比明显降低（P<0.05）;Vehicle组大鼠在第14d的MWT与给药前（0 day）相比无明显变化。2.Morris水迷宫实验结果:与对照组（Vehicle组）相比,PTX组大鼠在给药后第8天至第15天逃避潜伏期延长,穿越原平台次数减少（P<0.05）;与PTX组相比,THD+PTX组大鼠在给药后第8天至第15天逃避潜伏期缩短,穿越原平台次数增多（P<0.05）。3.TUNEL法检测大鼠大脑皮层和海马CA1区神经细胞凋亡实验结果:PTX组同Vehicle组比较,大脑皮层和海马CA1区神经细胞凋亡增加,具有显著差异（P<0.05）;THD+PTX组大脑皮层和海马CA1区神经细胞凋亡数与PTX组相比明显减少,有统计学差异（P<0.05）。4.Western blot分析显示:与Vehicle组相比,PTX组cleaved caspase-3和TNF-α蛋白表达明显增高（P<0.05）;与PTX组相比,THD+PTX组cleaved caspase-3和TNF-α蛋白表达显著降低（P<0.05）。5.免疫组织化学检测结果显示:与Vehicle组比较,PTX组大鼠caspase-3和TNF-α的阳性细胞数增多（P<0.05）;与PTX组相比,THD+PTX组caspase-3和TNF-α的阳性细胞数则减少（P<0.05）。结论:紫杉醇诱发神经痛大鼠大脑皮层和海马神经元细胞凋亡增多、caspase-3表达上调、MDA含量增多、学习记忆能力受损。给予TNF-α抑制剂Thalidomide治疗后,可使紫杉醇诱发神经痛大鼠大脑皮层和海马神经元细胞凋亡减少、caspase-3表达下调、MDA含量减少,促进大鼠学习记忆功能的恢复。