研究背景：肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增殖而形成的异常病变组织。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。肿瘤,特别是恶性肿瘤(癌症)严重危害人类的健康和生命,而且癌症的发病率和死亡率逐渐上升。癌症已经成为21世纪人类的第一杀手,并成为全球最大的公共卫生问题之一。肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的微环境有密切的关系。肿瘤微环境是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞等共同组成。微环境条件对调控肿瘤发生和发展起着至关重要的作用。缺氧是实质性肿瘤物理微环境之一,对肿瘤的生物学特性有着重要的影响。人类恶性实质性肿瘤内部存在一定的缺氧区域,缺氧影响缺氧诱导因子(HIF)及其相关下游基因的表达,直接干预肿瘤的发展、转移及预后。HIF-1α是诱导BNIP3表达的最强刺激因子,缺氧可促使BNIP3mRNA和蛋白表达上调。人的BNIP3基因有BNIP3L,BNIP3a(Nix), BNIP3h等成员,属于Bcl-2家族中的BH3-only蛋白表达基因,与Bcl-2和Bcl-xl相互作用发挥其促细胞凋亡的作用。研究表明Nix蛋白主要通过靶向作用于线粒体的方式诱导肿瘤细胞凋亡。缺氧诱导的Nix基因稳定表达能抑制肿瘤细胞的生长,甚至引起肿瘤细胞死亡。缺氧诱导的人胶质瘤U251细胞BNIP3基因表达上调能促使细胞发生凋亡。缺氧诱导高表达的BNIP3蛋白通过抑制mTOR通路的活性来增强悬浮培养的肝癌细胞的自我吞噬能力,从而加速肝癌细胞的凋亡。然而另有许多研究者认为BNIP3和Nix能促进肿瘤细胞的生长,对肿瘤细胞起保护作用。与正常乳腺组织相比,乳腺癌组织BNIP3和Nix mRNA表达水平明显增高。在实质性肿瘤内部缺氧区域,高表达的BIIP3蛋白并不与细胞的凋亡共存。而当敲除BNIP3和Nix基因后,肿瘤细胞受缺氧诱导发生凋亡。这就意味着Nix在肿瘤发展进程中似乎扮演着一个双刃剑的角色,它在调控肿瘤生物学行为方面的作用尚存在分歧。核内转录因子NF-κB的异常表达与人体免疫,炎症以及肿瘤的发生发展、侵袭、转移等密切相关。目前已阐明活化的NF-κB可以促进肿瘤生长,阻断NF-kB的活化可抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。当肿瘤组织直径达到400μm时,其内部即可形成缺氧区域,缺氧诱导因子(HIF)表达上调,进而激活核内转录因子NF-κB信号传导通路,肿瘤细胞自身产生促炎介质,最终使肿瘤细胞适应缺氧环境。肿瘤缺氧微环境中,激活的NF-κB调控细胞凋亡信号途径,使肿瘤细胞产生耐肿瘤药物和抗电离辐射的能力,进而降低肿瘤细胞死亡的危险。人类恶性神经胶质瘤组织中NF-κB处于持续激活状态,它参与胶质瘤广泛的生命活动,包括肿瘤细胞的生长、抗凋亡、血管生成、肿瘤侵袭及远处转移。NF-κB可调控多种凋亡抑制因子如c-IAP1、c-IAP2的表达,还可以通过与肿瘤抑制剂蛋白如p53等相互作用实现抗肿瘤细胞凋亡功能。然而在影响肿瘤发生发展的分子机制研究方面,尚无相关文献报道NF-κB活性和促凋亡蛋白Nix之间的关联性。目前肿瘤研究大多依赖2D(二维)培养系统,但是该体系不能很好的模拟体内实体肿瘤的微环境,而且所得的研究结果也并不能完全体现体内实体肿瘤的真实性。另外通过在小动物体内注射肿瘤细胞或者移植肿瘤组织的方法建立的动物肿瘤模型已经得到大多数研究学者的认可,这也是目前进行肿瘤研究的一个金标准。然而动物肿瘤模型有一定的局限性,注射到动物体内的肿瘤细胞会受到动物体内各种环境的影响,体内的肿瘤细胞难免会发生不可控制的基因及相关蛋白表达的改变。因此这就要求我们有必要寻找一种更好的研究方法来代替2D培养系统和动物模型构建。近年来许多组织工程方法构建的3D(三维)体外肿瘤模型正在用以模拟体内实体肿瘤微环境来研究肿瘤发生发展的分子机制及进行体外肿瘤药物渗透研究。3D体外培养的肿瘤组织中存在不同表型的肿瘤细胞,包括增殖细胞、非增殖细胞以及坏死细胞等,这些更加接近体内完整的肿瘤组织。因此,3D体外组织构建就为我们研究肿瘤提供了一种比应用动物模型更快捷、更简单、更经济的可靠选择。研究表明3D体外肿瘤模型能够上调表达与体内肿瘤生长相关的各种关键因子。基于Ⅰ型胶原蛋白制备的3D体外肿瘤模型内部150-200μm缺氧区域的肿瘤细胞HIF-1α表达上调,细胞发生凋亡。3D体外组织构建多以三维多细胞肿瘤球体模型为主,这类肿瘤模型的内微环境异质性与体内肿瘤相似,含有大量的细胞-基质,细胞-细胞相互作用的三维网络结构。在以往的研究中,印度柞蚕丝蛋白、不可降解的交联聚甲基丙烯酸羟乙酯的水凝胶、肿瘤纤维化组织、Ⅰ型胶原蛋白等生物材料推动了三维组织构建方法研究的发展。近年来壳聚糖作为组织工程支架及载体材料研究广泛。可溶性的壳聚糖载药微球体实现了对骨缺损的修复。壳聚糖的衍生物-羟丁基壳聚糖(HBC)作为一种具有水溶性和温敏特性的天然高分子化合物在疾病治疗和防止术后粘连方面的研究对临床工作也具有一定的指导意义。然而对于羟丁基壳聚糖在3D体外组织构建方面的应用研究报道较少。本课题第二部分初步探讨3D培养条件下模拟肿瘤细胞缺氧状态,进一步检测分析Nix蛋白表达对肿瘤生存的影响。目的：1、2D培养条件下,初步研究缺氧诱导的肿瘤细胞Nix表达和核内转录因子NF-κB活性改变的相关性,为肿瘤分子靶向治疗研究提供理论依据；2、初步探讨3D体外肿瘤模型在肿瘤实验研究中的意义,应用3D体外培养体系简单模拟体内肿瘤细胞生长的缺氧微环境,为进一步研究缺氧诱导表达的Nix蛋白对肿瘤发生发展的作用提供更优越的平台。方法：1、细胞培养。购买人神经胶质瘤U251细胞株,复苏,传代,将传代的U251细胞分两组：缺氧培养组(5%C02+95%N2)和常规培养组,时间6h,提取总蛋白Western blot分析Nix蛋白表达情况。2、构建稳定的U251细胞亚系。根据说明书指示,配制DMEM+10%FBS370C预热,转染前24h传代HEK293T细胞,细胞融合40%时开始转染,将配好的转染液加入到HEK293T细胞的培养皿中,37℃,5%CO2培养24h后补加新鲜培养基继续培养60-70h后,收集含病毒的培养基。用含10%FBS,100U/ml青霉素,100gg/ml链霉素的DMEM/F12培养基,37℃,5%CO2培养箱中常规培养U251人神经胶质瘤细胞。隔天换液,待细胞融合率达80%时用含0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶液消化传代。构建靶向Nix基因的shRNA(TCAACATCAA ACATGATCTGC)真核表达载体,转染U251细胞(Nix-kn,敲除Nix基因),shRNA (ACCTCATAACAAATTCTAGGC)作为对照(Nix-wt,未敲除Nix基因)。稳定的U251细胞亚系缺氧培养6h(5%CO2+95%N2),提取总蛋白,Western blotting检测Nix,NF-KB/p65, i-KBa和p-NF-KB/p65等蛋白的表达情况。3、3D体外组织构建模拟肿瘤缺氧环境。用合作单位提供修饰良好的羟丁基壳聚糖(HBC)生物材料。用钻-60辐照消毒HBC。在1.5ml的EP管中将10mg羟丁基壳聚糖用含10%FBS、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640培养基400μl于冰水中溶解,配成2.5%的HBC溶液。用含10%FBS、1×105/L青霉素、100mg/L链霉素的1640培养基,于37℃置于5%C02培养箱中常规培养人786-0肾癌细胞系。待贴壁细胞融合率达80%,胰酶消化细胞,用约50μl培养基重悬细胞,调节细胞悬液浓度为1×106/L。将配好的2.5%的HBC溶液取出,放于冰上,然后将上述细胞悬液加入到HBC溶液中,反复轻轻吹打混匀,取100μl滴入37℃培养基中,迅速形成复合肾癌细胞的球形凝胶,直径约3mm。将球形凝胶置于37℃、含5%CO2的培养箱中常规培养1天,3天,15天,25和40天。为了避免贴壁细胞对肿瘤模型生长的影响,将凝胶小球更换到另一新的6孔板孔内,继续培养。取出凝胶小球,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定24h,冰冻切片做H&E染色方法检测细胞形态,免疫荧光检测Nix蛋白的表达。2.5%戊二醛固定凝胶24h,扫描电镜检测HBC凝胶切面形态。结果1、Western blot方法检测：与正常条件培养的U251细胞相比,缺氧条件(5%CO2+95%N2)下培养的U251细胞内Nix表达明显较高,差异有统计学意义(t=-966.353,p<0.001)。2、Nix-wt U251细胞和Nix-kn U251细胞在缺氧条件下(5%CO2+95%N2)培养6h,Western blot结果显示：Nix-wt(未敲除Nix基因)的U251细胞组受缺氧诱导表达Nix蛋白,p-NF-κB/p65表达量明显高于Nix-kn(敲除Nix基因)的U251细胞组,差异有统计学意义(t=39.881,p<0.001),受缺氧诱导,NF-κB只在Nix-wt U251细胞中得到激活。而NF-κB的抑制剂蛋白i-κBa在Nix-wt U251细胞中表达降低,在Nix-kn U251细胞中表达较高,差异有统计学意义(t=-3.578,p=0.023),但两组NF-κB/p65表达水平差异无统计学意义(p>0.05)。3、扫描电镜结果示HBC凝胶具有多孔性的三维网络结构,空间网络较大,网间空隙较小,利于水分和营养物质的渗透。细胞贴附于HBC材料上,生长良好,细胞-细胞,细胞-基质之间相互作用形成肿瘤细胞生长的3D空间环境。4、H&E染色观察细胞生长状态良好,核大、清晰,形状不规则,染色较深,核浆比例失调；培养第1天,肿瘤细胞多呈单个存在；3天后,肿瘤细胞开始增殖,形成少量较小的细胞集群；25天细胞增殖明显,形成大量较大的细胞集群。5、免疫荧光检测结果示：培养25天,激发绿色荧光(Nix表达阳性),DAPI染色细胞核清晰；培养40天未激发绿色荧光(Nix表达阴性),DAPI染色细胞核不清晰,DNA降解,呈现大量核碎片,细胞凋亡。结论1、2D培养条件下缺氧诱导的肿瘤细胞Nix表达与NF-κB活性改变相关,Nix可能促进NF-κB通路的激活。2、基于羟丁基壳聚糖制备的3D体外肿瘤模型简单模拟出体内实体肿瘤的部分缺氧微环境,缺氧诱导的Nix表达可能促使肿瘤细胞的浸润和转移。