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牙髓炎是口腔最常见的疾病之一，研究表明感染性牙髓炎主要的致病菌是G~-菌，而内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是主要的毒力因子。实验研究发现，LPS能诱导单核-巨噬细胞、成纤维细胞等细胞分泌多种炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8等，产生炎症级联反应，导致血管通透性增加、牙髓腔内渗液增多、髓腔压力增大，从而引起牙髓炎症状。因此研究拮抗LPS的治疗措施，降低LPS对牙髓细胞的毒性作用，对牙髓炎的防治和活髓的保存具有重要意义。 葛佬素(Gloverin)是一种存在于蚕蛹中的抗菌肽，分子量为13.8KD。该蛋白可结合LPS，阻断LPS的生物学效应，是一种具有杀灭G~-菌、中和LPS双重作用的抗菌肽。虽然本实验室前期将葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中进行了表达，同时证明该表达产物具有杀灭大肠杆菌J5的作用，但是由于葛佬素在COS-7细胞中表达量还很低，远不能满足科研及临床应用的需要，因此利用原核表达系统表达具有生物活性的重组葛佬素多肽，成为获得大量葛佬素以及进一步研究其生物学效应的一种选择。 本研究目的即在采用基因工程技术对葛佬素蛋白进行重组表第四军医大学博十学位论文达，观察该蛋白体外中和LPS的活性以及对原代牙髓细胞炎性细胞因子IL一1日释放的影响，为葛佬素的进一步应用研究奠定理论基础。 本研究首先采用PlvEx2.3载体构建葛佬素原核表达质粒PlvEx2.3一G，表达产物c末端带有聚组氨酸的标签。该标签对表达的蛋白活性和结构影响很小，但为表达蛋白的鉴定和纯化带来了极大的方便。然后应用快速翻译系统500(Rapid Translationsystem 500，RTS500)对目的蛋白进行快速表达和初步鉴定。RTS系统是一种非细胞翻译系统，是以无活性的大肠杆菌裂解产物为底物进行蛋白的体外合成，可以克服细胞表达体系中不可溶(形成包涵体)、细胞毒性或容易被降解等主要问题。PlvEX2.3一G通过RTSSOO表达后产物SDS一队GE电泳结果显示表达产物分子量约为14KD;蛋白免疫印迹结果显示该蛋白带有聚组氨酸标签;采用生物传感器对表达蛋白进行生物活性初步分析结果显示表达产物与类脂A(I iPidA)有一定的亲和性。 由于RTS500系统试剂盒较昂贵，且只能作有限次表达反应，表达量无法完全满足生物活性研究的需要。因此在以上工作基础上，我们应用活的大肠杆菌BL21(DE3)对目的蛋白进行表达及纯化，以期获得大量的目的蛋白。 重组质粒plvEx2.3一。转化BL21(DE3)并经IPTo诱导后，收集细菌并对细菌进行超声破碎，SDS一队GE电泳结果显示分子量为14KD的表达产物主要存在于超声碎菌后的菌液上清中;蛋白免疫印迹结果显示该蛋白带有聚组氨酸标签;应用NiZ气NTA鳌合物树脂对表达产物进行纯化，结果显示纯化后的蛋白纯度达到95%以上。采用宣试剂对表达产物的生物学活性研究结果表明该表达产物对LPS具有明显中和活性，并呈明显的剂量效应关系。以上生物化学、免疫学尤其是生物活性分析，表明该表达产物即第四军医大学博士学位论文为重组葛佬素。 在体外培养的原代牙髓细胞模型中，重组葛佬素蛋白能够抑制LPS刺激后牙髓细胞炎性细胞因子IL一lp的释放。 综上所述，本研究应用基因工程方法成功构建了抗菌肤葛佬素原核表达载体，并进行了体外快速表达和原核表达;最终获得的重组葛佬素蛋白能够中和LPS，能够抑制LPS诱导的原代牙髓细胞炎症细胞因子比一lp的释放，为牙髓炎中活髓保存提供了新的思路。