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背景:急性肺损伤(ALI)是临床常见危重症,临床上以严重低氧血症、弥漫性肺泡上皮和肺血管内皮细胞损伤导致的肺水肿为主要特征,死亡率较高。该病的发病机理错综复杂且未完全阐明,目前认为ALI的本质是一种炎症失控出现过度的炎症反应[1],目前仍缺乏特异的治疗方法。过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)是核受体超家族非类固醇激素受体中一员,最近研究表明PPARγ在肺部有着广泛表达[2-8],并且发现PPARγ具有抗炎效应对ALI具有保护作用[9-11]。然而既往对PPARγ在炎症情况下发生变化的机制研究不够深入,文献已显示活化PPARγ后对NF-κB有抑制作用,但NF-κB能否直接调节PPARγ尚不清楚,且PPARγ对体外培养的肺泡上皮细胞是否也有保护作用未见研究。为此本文通过干预巨噬细胞NF-κB的表达来观察其对PPARγ的调控作用,并通过PPARγ激活剂曲格列酮活化PPARγ,观察其在LPS致伤肺泡Ⅱ型上皮细胞后的保护作用。旨在为PPARγ激活剂用于防治ALI提供理论依据。目的:探讨NF-κB对PPARγ表达的调控作用,并研究曲格列酮活化PPARγ后对LPS所致肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护效应及机制。方法:1.将体外培养的Ana-1细胞按随机数字表法分为对照组,0.1 mg/L LPS作用1、2、4、8h组,50 mg/L SN50作用4h组(SN50组),NF-κB高表达质粒转染组。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PPARγ、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α蛋白表达变化。构建NF-κB高表达质粒,利用脂质体转染巨噬细胞并通过G418筛选出稳定表达株,用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测LPS、SN50作用后及质粒转染后细胞核内PPARγ表达和NF-κB p65亚基核移位情况。2.通过酶消化分离和免疫黏附法纯化,原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,将所培养的细胞按随机数字表法分为对照组、LPS组、曲格列酮组和曲格列酮+GW9662组。行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)、TNF-α、mRNA的改变,免疫荧光法和Western blot法检测SP-A蛋白表达,ELISA法检测TNF-α蛋白表达变化,流式细胞仪检测细胞经AnnexinⅤ/PI双染后凋亡和坏死情况。结果:1.在致炎因子LPS作用下,PPARγ的表达下降(P <0.05),这一变化伴随p65核移位增加和炎症因子TNF-α的升高(P均<0.05)。2.成功构建了NF-κB高表达质粒并将其转染到巨噬细胞中实现了p65高表达。3. LPS刺激和NF-κB高表达质粒转染Ana-1细胞造成p65表达升高时,核内PPARγ表达减少(P<0.05);而使用NF-κB抑制剂SN50作用Ana-1细胞抑制p65表达后,核内PPARγ表达升高(P<0.05)。4.经碱性磷酸酶、SP-A和电镜鉴定,原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞成功。5.在致炎因子LPS作用下,肺泡Ⅱ型上皮细胞的SP-A表达下降(P<0.05),这一变化伴随炎性因子TNF-α的升高和细胞凋亡和坏死的增多(P<0.05)。6.曲格列酮干预后,可以显著减少TNF-α释放和细胞凋亡和坏死(P<0.05),SP-A的表达随之上调(P<0.05)。合用GW9662可以阻断曲格列酮的效应。结论:1.在致炎因素LPS作用下,Ana-1细胞PPARγ表达下降,同时伴有NF-κB核移位增加和其调控的炎性因子TNF-α大量释放。提示在炎症反应中PPARγ表达降低可能与NF-κB活化有关。2.通过构建NF-κB高表达质粒转染Ana-1细胞改变其基因型实现NF-κB过表达,引起核内PPARγ表达减少,使用NF-κB抑制剂SN50抑制NF-κB核易位后,核内PPARγ表达升高,证实NF-κB对PPARγ的表达存在抑制效应。3.致炎因子LPS在引起肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性因子TNF-α的升高和细胞凋亡和坏死的增多的同时,可导致SP-A表达下降。曲格列酮活化PPARγ后,可以显著减少TNF-α释放和细胞凋亡和坏死,上调SP-A的表达,从而发挥对肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用。