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目的:伴随人口老龄化加剧和人们生活水平的提高,以及不良的生活方式,心血管疾病、糖尿病、高脂血症等发病率逐渐增加,成为威胁人类健康的一大“杀手”。血管内皮功能障碍与动脉粥样硬化、糖尿病和高脂血症密切相关,血管内皮细胞中氧化代谢产物积累和氧化应激导致内皮功能障碍。铁死亡是近年来发现的一种细胞死亡方式,大量研究表明脂质过氧化在铁死亡中具有重要作用,酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)是调节脂质成分的关键酶,尤其是通过对磷脂酰乙醇胺(PE)进行调节,ACSL4可促进脂质过氧化,进而促进细胞铁死亡发生,ACSL4催化包含花生四烯酰基(AA)和肾上腺素酰基(Ad A)的PE优先氧化是铁死亡出现的主要原因。噻唑烷二酮类(TZDs)药物是一种胰岛素增敏剂,最近研究发现,罗格列酮(RSG)可特异性抑制ACSL4,而对ACSL其他亚型并无明显抑制作用,我们假设RSG通过抑制ACSL4减轻脂质过氧化产物和氧自由基(ROS)的蓄积,维持膜生物完整性,从而在减轻铁死亡对细胞损伤方面发挥保护作用,RSA选择性致死化合物(RSLs)包含Erastin和RSL3可作为铁死亡诱导剂。本实验研究RSG是否可以减轻RSL3诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生的铁死亡,探讨RSG抑制铁死亡的机制,并观察RSG和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1是否存在相互作用,这可能为改善因铁死亡引起的组织、细胞损伤和治疗慢性疾病提供一个新的策略。方法:1.检测RSL3的细胞毒性:应用不同浓度(0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM)的RSL3溶液处理HUVEC,通过CCK-8方法在6h、12h和24h检测细胞增殖情况,确定RSL3最适的作用浓度和时间;2.RSL3诱导细胞铁死亡:使用1μM浓度的RSL3处理HUVEC 12h,同时加入铁死亡抑制Ferrostatin-1干预细胞,通过CCK-8法检测Ferrostatin-1对HUVEC细胞生存率的影响,并通过RT-PCR法和蛋白免疫印迹电泳检测不同干预组细胞内铁死亡标志性因子GPX4、SLC7A11 m RNA及蛋白表达水平,确定细胞铁死亡情况,构建RSL3诱导HUVEC铁死亡模型;3.RSG的细胞毒性:不同浓度RSG(0μM、1μM、15μM、25μM、50μM、75μM)溶液处理细胞并培养24h,通过CCK-8方法检测细胞增殖情况;4.RSG与脂质过氧化水平:用硫代巴比妥酸(thiobar bituric acid,TBA)法检测经RSG(0μM、1μM、15μM、25μM)预处理后各组细胞上清夜中MDA含量,来反映脂质过氧化水平;并采用DCFH-DA免疫荧光染色法检测不同浓度RSG和Ferrostatin-1干预后各组ROS含量;5.RSG与铁死亡:在前期构建的铁死亡细胞模型上,加入RSG等不同药物干预后,Western Blotting检测铁死亡标志性因子ACSL4、GPX4、FTH1、COX2蛋白的相对表达量,RT-PCR检测ACSL4、GPX4 m RNA的表达水平,探讨RSG抑制铁死亡可能的分子作用机制。结果:1.RSL3的CCK-8结果显示:与对照组相比,HUVEC经过RSL3以不同浓度和不同时间处理后,RSL3以剂量和时间依赖的方式降低细胞活力;选择1μM浓度的RSL3干预12h构建HUVEC细胞损伤模型;2.RSL3诱导细胞铁死亡:相比与对照组,加入RSL3药物干预的细胞RT-PCR和蛋白免疫印迹电泳结果显示,铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11表达显著下调,Ferrostatin-1和RSL3共培养可提高HUVEC生存率,并在基因水平和蛋白水平上逆转HUVEC内GPX4、SLC7A11表达情况,说明成功建立了RSL3诱导HUVEC细胞铁死亡模型,Ferrostatin-1有效抑制铁死亡;3.RSG CCK-8结果显示:HUVEC经低浓度(≤25μM)的RSG处理后,细胞增殖情况与无RSG对照组相比无明显差异(P>0.05),而较高浓度(≥50μM)的RSG可抑制细胞增殖,对细胞具有毒性;4.RSG抑制细胞内脂质过氧化水平:细胞经RSG干预后,检测细胞内脂质过氧化产物MDA含量呈下降趋势,DCFH-DA免疫荧光染色结果显示ROS蓄积减少,小剂量的RSG具有显著的抑制效果;5.RSG对细胞铁死亡相关因子的影响:蛋白免疫印迹电泳结果显示,与RSL3干预组相比,RSG预处理组细胞内ASCL4、COX2表达水平明显降低(P<0.05),GPX4蛋白水平上调,FTH1蛋白表达无明显差异;与单用Ferrostatin-1组相比,Ferrostatin-1和RSG共同作用细胞后ACSL4蛋白表达显著下调,GPX4蛋白水平显著上调,RT-PCR和蛋白免疫印迹电泳结果一致。结论:研究结果表明,(1).RSL3成功诱导HUVEC铁死亡,RSL3以剂量和时间依赖的方式降低细胞生存率,RSL3干预组在基因水平和蛋白水平GPX4、SLC7A11表达显著下调,Ferrostatin-1组减轻RSL3的细胞毒性作用,提高HUVEC存活率,并在基因水平和蛋白水平上调GPX4、SLC7A11表达,说明RSL3成功诱导HUEVC细胞铁死亡,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可逆转这一现象。(2).RSG干预组检测MDA含量、ROS蓄积呈下降趋势,RSG组下调ASCL4、COX2蛋白表达水平,上调GPX4蛋白的表达,RSG抑制ACSL4 m RNA相对表达量、上调GPX4 m RNA相对表达量,Ferrostatin-1组在蛋白和基因水平上对ACSL4、GPX4的调节作用同RSG相似,RSG+Ferrostatin-1组较二者单用干预作用更为明显。ACSL4活化不饱和脂肪酸(PUFA)生成PUFA-Co A,PUFA-Co A通过溶血磷脂胆碱单碱基转移酶3(LPCAT3)进行脂质重塑,生成PUFA-PE,通过脂氧合酶(ALOX)和二价铁催化的Fenton反应生成有害的脂质过氧化氢(L-OOH),一方面L-OOH大量积累直接诱发铁死亡,另一方面LOOH通过GPX4被还原为无毒的脂醇(L-OH),当GPX4失活或活性受到抑制时,导致L-OOH的积累和膜脂质过氧化损伤,触发铁死亡,RSG可能通过靶向抑制ACSL4或增加GPX4活性,减少铁死亡下游通路脂质过氧化产物和ROS的蓄积,从而减轻细胞铁死亡,此外研究还发现Ferrostatin-1和RSG在减轻铁死亡方面存在协同作用。