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目的:急性重症胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)发病率及死亡率高,但机制尚不明确。本实验通过研究NLRP3/Caspase-1炎症通路在SAP肺损伤模型中的活化来探讨急性重症胰腺炎肺损伤(severe acute pancreatitis associated acute lung injury,SAP-ALI)的发病机制。通过研究中药大黄素对NLRP3/Caspase-1信号通路上关键分子的影响,探讨大黄素在抑制急性胰腺炎肺损伤疾病的作用机理,为临床上中西医结合防治急性胰腺炎肺损伤提供新思路。方法:实验一:SD大鼠随机分成假手术组(Sham组)、疾病模型组(SAP组)、大黄素干预组(EMO组)和地塞米松干预组(DEX组),每组10只。使用4%苯巴比妥(30-40mg/kg)麻醉,Sham组开腹后仅轻轻翻动胰腺3次后关腹。SAP组、EMO组、DEX组大鼠均经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(1ml/kg)建立SAP模型。EMO组在造模后2h、12h给大鼠大黄素混悬液灌胃,剂量为40mg/kg。DEX组在造模后2h给大鼠腹腔注射地塞米松,剂量为10mg/kg。术后24h开始检测,分别检测各组大鼠胰腺组织及肺组织的湿/干比及血清淀粉酶的水平;采用H&E染色法观察大鼠胰腺和肺组织的病理变化;采用流式细胞术检测大鼠肺组织的凋亡情况;Westetn blot检测大鼠肺组织中凋亡相关蛋白Caspase3、Bax和Bcl2的表达;采用免疫组织化学法检测各组大鼠肺组织中Caspase3的表达分布。实验二:SD大鼠随机分成假手术组(Sham组)、疾病模型组(SAP组)、大黄素干预组(EMO组)和地塞米松干预组(DEX组),每组10只。动物处理方式同实验一。采用Westetn blot法检测NLRP3/Caspase-1信号通路蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表达水平;采用ELISA法测定各组大鼠血清中炎症因子IL-1β和IL-18水平;采用免疫组织化学法测定各组大鼠肺组织中中性粒细胞特异性抗体Ly6G的数量来判断肺组织的中性粒细胞浸润情况;磁珠分选法提取外周血的中性粒细胞,采用Westetn blot法检测中性粒细胞的迁移蛋白i CAM和IL-8的表达变化。实验三:正常SD大鼠15只,每只大鼠腹主动脉采血5ml,磁珠分选法分离中性粒细胞,少部分中性粒细胞用于纯度检测(流式细胞法),剩余大部分用于体外培养。10%FBS的DMEM培养基在37度孵箱中培养中性粒细胞。体外培养后的中性粒细胞分为五组:正常对照组(CON组)、LPS组、LPS+NLRP3抑制剂MCC950组(LPS+MCC950组)、LPS+DEX组、LPS+EMO组。对应给药的终浓度的50 ng/m L LPS、400 n M MCC950、100 n M DEX、30μg/m L EMO,孵育反应24 h收取细胞。采用RT-PCR检测TNF-α、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β基因的m RNA表达;采用Westetn blot检测TNF-α、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达。结果1.各组大鼠解剖后观察,发现SAP组大鼠肠管变暗紫,胰腺组织大面积坏死,肺脏无色泽且有瘀血,加入大黄素和地塞米松干预后明显缓解。与假手术组相比,胰腺组织及肺组织的湿/干比显著升高(P<0.05)、SAP组的血清淀粉酶的水平显著升高(P<0.01)、胰腺和肺组织的H&E病理学评分显著升高(P<0.01)、肺组织凋亡比例明显增加(P<0.001)、肺组织中的凋亡相关蛋白的Caspase3、Bax的表达水平明显升高(P<0.001)、Bcl2的表达明显降低(P<0.01)、肺组织中Caspase3表达分布增多(P<0.01)。在加入大黄素及地塞米松干预后,与SAP组大鼠相比,以上指标均有改善,且有统计学意义(P<0.05)。值得注意的是,在检测血清淀粉酶水平、肺组织凋亡比例、肺组织中的凋亡相关蛋白Caspase3、Bax的表达时,大黄素组比地塞米松组效果更好,且有统计学差异(P<0.05)。2.对照假手术组,SAP组的肺组织中NLRP3/Caspase-1通路相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1表达明显升高(P<0.01)、血清中炎症因子IL-1β及IL-18的表达明显升高(P<0.001)、肺组织中中性粒细胞特异性抗体Ly6G数量增多明显(P<0.001)、外周血的中性粒细胞迁移蛋白i CAM和IL-8的表达显著增强(P<0.05)。加入地塞米松和大黄素干预后,以上指标的表达均明显下降,且有统计学意义(P<0.05)。值得注意的是,对照地塞米松组,大黄素组对以上各检测指标的干预效果更加明显,且差异有统计学意义(P<0.05)。3.与对照组细胞比较,LPS刺激中性粒细胞后,TNF-α和NLRP3/Caspase-1通路中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的m RNA和蛋白的表达水平较都显著升高(P<0.01),加入NLRP3抑制剂MCC950、大黄素干预后,以上指标的m RNA和蛋白的表达水平相比LPS组都显著降低(P<0.05),地塞米松组的以上指标的蛋白表达显著降低(P<0.05)。而且大黄素和MCC950的干预效果比地塞米松更好,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.SAP肺损伤时胰腺和肺损伤明显且肺组织细胞凋亡加重。2.NLRP3/Caspase-1通路在急性重症胰腺炎肺损伤模型中被激活,并促进中性粒细胞的迁移及在肺组织中的浸润,进而加重肺损伤。3.抑制中性粒细胞内NLRP3炎症小体的活化可减少炎症因子的释放,缓解急性胰腺炎肺损伤。4.大黄素通过抑制NLRP3/Caspase-1通路的活化可缓解急性重症胰腺炎肺损伤。