生殖健康是人类健康的重要组成部分。不孕不育、女性健康障碍以及出生缺陷等疾病与女性生殖细胞发育息息相关。人类雌性生殖干细胞(FGSCs)的发现为理解卵子发生、推迟绝经期、治疗不育症以及保存生育力等方面开辟了新的途径。育龄期妇女卵巢组织主要通过开腹手术和腹腔镜手术获得,其来源匮乏制约着FGSCs的基础研究和临床应用。在辅助生殖中心采集卵母细胞时需要在超声引导下进行阴道卵巢穿刺抽吸,该操作过程会产生“卵泡抽吸物”(FAs)。全球每年至少有100,0000例FAs在收集卵母细胞后被丢弃,造成了大量临床资源的浪费。前期研究发现FAs中存在腔前卵泡,暗示卵母细胞的一个新来源。因此,我们假设含有FGSCs的少量卵巢组织能够经卵巢穿刺收集到FAs中。本研究的目的是从废弃的FAs中获得FGSCs并研究其体内外发育机制。本研究以手术切除的少量卵巢组织和IVF中心废弃的FAs为研究材料。首先,使用免疫荧光组织化学鉴定卵巢组织中是否存在具有增殖活性的生殖细胞,并从手术切除的卵巢组织中分离、培养FGSCs(srFGSCs)。其次,使用细胞筛网从FAs中获得少量卵巢组织并从这些组织中获得FGSCs(faFGSCs)。经体外长期培养后,建立细胞系并分析该细胞系的特征,包括使用免疫荧光化学和RT-PCR分析细胞的生殖系特征;使用BrdU掺入分析细胞的增殖活性以及核型分析和碱性磷酸酶活性检测等。然后,系统研究了faFGSCs的体内外发育机制,包括ⅰ)通过去除饲养层研究faFGSCs体外分化潜能;ⅱ)通过添加颗粒细胞和视黄酸(RA)研究faFGSCs和颗粒细胞的互作和ⅲ)减数分裂活性以及ⅳ)通过卵巢注射并异位移植后分析faFGSCs与周围体细胞形成卵泡的能力。最后,建立并优化了faFGSCs体外诱导分化体系。我们发现人类卵巢皮质中存在具有增殖活性的生殖细胞并能从中获得srFGSCs以及建立该细胞系。我们也发现FAs经细胞筛网过滤后能观察到少量卵巢组织黏附在尼龙网上并广泛存在于FAs中,其中部分组织含有腔前卵泡。与手术切除获得的卵巢组织一样,这些组织也能够用于建立FGSCs系。faFGSCs具有与srFGSCs相同的生殖干细胞特征,包括生殖细胞的基因表达情况,细胞形态和增殖特征等。faFGSCs系还具有正常的46,XX核型,表达较弱的碱性磷酸酶活性和细胞因子GDNF的受体GFRA1等特征。此外,faFGSCs具有体内外分化潜能:ⅰ)在无饲养层培养条件下自分化为卵母细胞;ⅱ)通过间隙连接和旁分泌途径与颗粒细胞进行沟通交流,以促进自身分化;ⅲ)在RA诱导下进入减数分裂以及ⅳ)与人类卵巢皮质中的体细胞形成嵌合卵泡。最后,我们通过建立三步法诱导体系,使faFGSCs体外分化为GV期卵母细胞。我们的结果表明FAs中存在少量卵巢组织。这些组织与手术切除获得的卵巢组织一样都能建立FGSCs系,体外能发育至GV期卵母细胞。综上所述,废弃的FAs能够为人类FGSCs提供新的来源并能用于临床应用和基础研究。从废弃的FAs中获取FGSCs既能降低手术风险,又能充分利用临床资源。