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一、MRSA对抗菌药物的耐药表型和基因型分析目的了解来自汕头和北京地区的67株MRSA的耐药情况及耐药机制,并分析耐药表型与基因型的一致情况。方法以琼脂稀释法测定24种抗菌药物对MRSA的体外抗菌活性,PCR扩增MRSA的耐药基因,nitrocefin测定细菌产β-内酰胺酶的情况。结果67株MRSA除了对氯霉素和多西环素的耐药率较低,分别为3%和7.5%,对万古霉素、米诺环素和利凡诺100%敏感外,对利福平的耐药率为52.2%,对四环素的耐药率为77.6%,而对于其它包括青霉素、第1-4代头孢菌素、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和磺胺类的耐药率均在80～90%以上,氨苄西林加酶抑制剂以后则耐药程度有所降低。qacA/B、mecA、tetM、NorA、gyrA、aac (6’)/aph(2”)、aph (3’) III和β-lactamase检出率分别为11.9%、95.5%、70.1%、4.5%、10.4%、82.1%、73.1%和92.5% ,未检出qacC、ant (6) -Ⅰ、ant (2″)-Ⅰ、VanA和VanB耐药基因。67株MRSA均携带有多种耐药基因:同时携带2种耐药基因的有7株,3种的有10株,4种的有11株,5种的29株,6种的10株。结论67株MRSA耐药情况严重,并同时携带多种耐药基因。二、绿茶浸出物对MRSA的抗菌作用及机制研究目的筛选绿茶抗MRSA的主要成分,观察绿茶和提取物与抗生素的协同抗菌情况,并进一步探讨绿茶浸出物对MRSA的抗菌机制。方法分别测定绿茶、青茶、白茶、红茶和黑茶对MRSA的MIC,并比较它们对MRSA的抗菌效果;测定茶叶的主要成分茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶色素和咖啡因对MRSA的MIC,推测绿茶抗MRSA的主要成分。用纸片扩散法测定绿茶浸出物及其提取物与抗生素抗MRSA的协同作用。以渗透试验检测MRSA对绿茶的蒸馏水和NaCl溶液的耐受情况。HPLC测定绿茶及其提取物对头孢唑啉在金葡菌菌体内蓄积量的影响。结果绿茶浸出物对MRSA的MIC范围为0.125%～0.5%;青茶浸出物为0.125%～0.5%;白茶浸出物为0.0625%～0.25%;红茶浸出物为0.5%;黑茶浸出物为0.25～0.5%。茶多酚为128～256μg/ml;茶色素为256～512μg/ml;茶多糖为512～1024μg/ml;茶皂素和咖啡因的MIC均大于1024μg/ml。绿茶浸出物对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢他啶、头孢替唑、米诺环素和四环素的抗MRSA作用有增效作用,与红霉素和氯霉素呈无关作用,与环丙沙星呈拮抗作用。茶多糖、茶皂素、茶色素、咖啡因与苯唑西林抗MRSA呈无关作用。茶多酚、ECg和EGCg与苯唑西林抗MRSA有增效作用。EC与苯唑西林抗MRSA呈无关作用。EC有进一步加强ECg对苯唑西林的抗MRSA作用。绿茶浸出物促进MRSA在蒸馏水和NaCl溶液中的破坏。经过绿茶浸出液、茶多酚、EC、ECg和EGCg预处理的金葡菌体内蓄积的头孢唑啉明显增多。结论五种茶叶对MRSA均有一定的抗菌作用,抗菌较强的是白茶和绿茶。绿茶浸出物能增强β-内酰胺类抗生素和四环素对MRSA的抗菌作用。绿茶抗MRSA主要成分为茶多酚,而且只有茶多酚才能增强苯唑西林对MRSA的抗菌作用。进一步筛选发现,茶多酚中的两个单体ECg和EGCg能增强苯唑西林对MRSA的抗菌作用。而EC能进一步加强ECg与苯唑西林对MRSA协同抗菌作用。通过绿茶的蒸馏水和NaCl溶液渗透试验,我们推断绿茶浸出物抗MRSA的机制可能与破坏细菌细胞壁有关。绿茶浸出物、茶多酚、EC、ECg和EGCg均能促进头孢唑啉在MRSA和ATCC菌体内蓄积。三、ECg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌机制研究目的测定ECg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用,并研究ECg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对MRSA的协同抗菌作用机制。方法以微量稀释法测定ECg、EGCg和β-内酰胺类抗生素的体外协同抗MRSA作用。以RT-PCR技术检测ECg、EGCg对lytM、lgrA基因表达的影响,并监测细菌自溶酶活性的变化。WB法测定EGCg对MRSA的PBP2a蛋白的影响。用超声破碎法提取β-内酰胺酶,测定ECg和EGCg对β-内酰胺酶的抑制情况,并与三唑巴坦的抑酶作用进行比较。结果50μg/ml的ECg/EGCg均能增强苯唑西林、头孢拉定、头孢呋辛、美罗培南对MRSA的抗菌作用,其中与美罗培南的协同效果比苯唑西林、头孢拉啶和头孢呋辛明显。在同等浓度下,ECg与β-内酰胺类抗生素的协同效果比EGCg明显。随着ECg和EGCg浓度的增高,MRSA的lytM、lgrA基因表达上调。而且EGCg浓度增加可导致产生的自溶酶增多。25、50和100μg/ml EGCg可使MRSA-2的PBP2a蛋白表达下调。三唑巴坦对金葡菌β-内酰胺酶有很强的抑制作用,浓度为256μg/ml时可完全抑制金葡菌的β-内酰胺酶,而EGCg/ECg对金葡菌β-内酰胺酶的抑制作用很微弱,浓度为409.6μg/ml的时,金葡菌β-内酰胺酶仍能使nitrocefin变色。结论ECg/EGCg与β-内酰胺类抗生素对金葡菌(包括MRSA和ATCC25923)的协同抗菌机制是由于ECg/EGCg作用于细胞膜,阻断细胞膜蛋白如PBP1,PBP3,PBP2a等的生成或抑制其活性,从而抑制细菌细胞壁的合成,并促进抗生素在菌体内蓄积,同时导致细菌自身发生自溶反应,但抑制β-内酰胺酶的作用很弱。四、表儿茶素没食子酸酯抑制金葡菌四环素外排泵的作用研究目的研究ECg与四环素对MRSA的协同抗菌作用并探讨其机制。方法以微量稀释法测定ECg与四环素的体外抗MRSA协同作用。用PCR技术筛选tetK基因阳性株和阴性株,以荧光法测定ECg/EGCg对tetK外排泵的抑制作用。结果ECg对MRSA和ATCC25923的MIC均为256μg/ml;四环素对MRSA的MIC值为2～128μg/ml,对ATCC25923为2μg/ml。合用25μg/ml的ECg与四环素后,15株MRSA中有5株呈协同作用,7株呈相加作用,2株呈无关作用,1株呈拮抗作用。ATCC25923呈相加作用。经ECg处理四环素释放曲线低于未经ECg处理的曲线。结论ECg与四环素对金葡菌主要呈协同或相加作用。其机制可能为抑制金葡菌的四环素外排泵。