第一部分白藜芦醇的心肌保护作用及其机制的研究缺血性心肌损伤是当今人类疾病导致死亡的主要原因之一。冠状动脉血流中断和再灌注致心肌坏死和心肌收缩功能丧失,称为心肌缺血/再灌注损伤。再灌注对心肌产生一系列影响,包括心肌超微结构的变化以及心肌能量代谢的变化。目前,缺血/再灌注损伤发生的机制尚未完全阐明。研究表明,自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、中性粒细胞、血管内皮细胞、细胞粘附因子与细胞凋亡等均参与缺血/再灌注损伤。其中,自由基和钙超载互为因果,在缺血/再灌注损伤中具有重要意义。近年来对心肌缺血再灌注损伤的研究取得了很大进展,很多动物实验证明许多药物能够减轻心肌缺血再灌注损伤。其中白藜芦醇（Resveratrol,化学名为3,4,5-三羟基二苯乙烯）的心肌保护作用受到广泛关注。这是因为白藜芦醇长久以来被认为是“法国悖论”的关键因素,即有喝红酒习惯的法国人虽然吃了很多高热量的饮食,但心血管疾病发病率却很低。白藜芦醇是一种在红酒和葡萄中存在的多酚类化学物质,具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症等生物学特性。目前研究认为,白藜芦醇通过诱导药物性预处理机制减轻缺血/再灌注损伤,但其详细的细胞信号转导和分子机制尚不清楚。最近研究表明,线粒体膜通透性转移孔（mitochondrial permeabilitytransition pore,mPTP）在心肌缺血/再灌注损伤中起关键性作用。缺血时,mPTP保持关闭状态,而再灌注时mPTP开放。而且研究发现,mPTP开放发生在再灌注早期而不是在缺血期。因此,在早期再灌注时如能有效地抑制mPTP的开放,是保护再灌注心肌的关键。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的作用最初认为是调节糖原合成,并参与细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖与分化、凋亡等过程。最近研究证实,GSK-3β在心肌保护中也起非常重要的作用,其机制主要是通过其Ser⁹位点的磷酸化,使其活性被抑制,进一步阻止mPTP的开放而保护再灌注损伤的心肌。鉴于以上研究,白藜芦醇在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用可能是通过GSK-3β的失活并抑制mPTP的开放而引起。因此,本研究对GSK-3β和mPTP在白藜芦醇诱导的心肌保护中的作用进行了初步探讨。本实验首先制备大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型（Langendorff装置）,用TTC染色法测定心肌梗塞面积。结果显示,离体大鼠心脏再灌注时给予白藜芦醇（10μmol/L）,可以明显减少心肌梗塞面积,明显增加再灌注时冠状动脉流量（coronary flow,CF）和左心室发展压（left ventricular-developed pressure,LVDP）。白藜芦醇的这种抗梗塞作用可被mPTP开放激动剂苍术苷（atractyloside）所逆转,提示白藜芦醇通过抑制mPTP的开放而保护再灌注心脏。另外,线粒体肿胀试验显示,白藜芦醇能够抑制Ca²⁺诱导的线粒体肿胀,再次证明白藜芦醇能够抑制心肌细胞mPTP的开放。其次,用Western blotting的方法检测离体大鼠心脏GSK-3β的磷酸化（Ser⁹位点）。结果显示,白藜芦醇明显增加再灌注时GSK-3β的磷酸化（Ser⁹位点）,说明白藜芦醇能够使GSK-3β失活。白藜芦醇抑制GSK-3β活性的作用被鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ所阻断,并且白藜芦醇使再灌注心脏血管扩张刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoporotein,VASP）的磷酸化增加,说明白藜芦醇诱导的GSK-3β磷酸化作用与鸟苷酸环化酶-环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（GC-cGMP-PKG）信号转导通路有关。由于GSK-3β失活可以抑制mPTP的开放,从而保护再灌注心肌,因此本实验进一步检测了线粒体GSK-3β的水平。结果显示,再灌注时给予白藜芦醇明显增加线粒体GSK-3β水平。由于在生理条件下GSK-3β主要存在于细胞浆,因此白藜芦醇使GSK-3β从细胞浆转移到线粒体,从而使GSK-3β有机会与mPTP结合。在分离的大鼠心肌细胞中,白藜芦醇使线粒体GSK-3β增加的作用同样被鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ所阻断,进一步证实cGMP-PKG信号转导通路介导白藜芦醇诱导的GSK-3β由胞浆向线粒体的转移。另外,利用免疫共沉淀方法探讨转移到线粒体的GSK-3β与mPTP成分相互作用时发现,GSK-3β与mPTP的组成成分亲和素D（Cyclophilin D,CypD）相结合,而不和外膜上的电压依赖性阴离子通道（the Voltage-Dependent Anion Channel,VDAC）或内膜上的腺嘌呤核苷酸转位酶（the Adenine-Nucleotide Translocase,ANT）相互作用,表明白藜芦醇通过诱导GSK-3β与线粒体膜成分亲和素D结合而抑制mPTP开放,从而保护心脏。小结1.白藜芦醇通过使GSK-3β失活而抑制mPTP开放,保护再灌注心肌。2.白藜芦醇通过cGMP-PKG信号转导通路使GSK-3β失活并诱导其从细胞浆转移至线粒体。3.转移至线粒体的GSK-3β最终与线粒体膜成分亲和素D结合而抑制mPTP开放,从而保护心脏。第二部分锌的心肌保护作用及其机制的研究锌存在于所有细胞中,除了构成细胞结构蛋白、酶、及转录因子外,其本身参与多种生理功能。它通过调节细胞信号识别、第二信使代谢、蛋白激酶的磷酸化等在细胞信号转导中起重要作用。最近研究报道,锌能够激活PI3K/Akt信号途径,抑制GSK-3β活性,而PI3K/Akt及GSK-3β在心肌缺血/再灌注损伤的保护中起重要作用。GSK-3β失活而阻止mPTP开放,是许多药物性预处理保护心脏的共同机制。因此,本实验利用H₉C₂大鼠心肌细胞株,探讨外源性锌能否通过抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的开放,从而保护缺血再灌注心肌细胞。本实验首先用ZnCl₂（10μmol/L）及锌载体Pyrithion处理H₉C₂细胞20分钟,然后利用Western blotting的方法分析GSK-3β磷酸化情况。结果显示,锌能使GSK-3β（Ser⁹）磷酸化明显增加,提示外源性锌可抑制H₉C₂细胞中GSK-3β的活性。其次,为了分析锌抑制GSK-3β的信号介导机制,本实验用PI3K、mTOR以及PKC抑制剂LY-294002、Rapamycin及Chelerythrine处理了细胞。结果显示,锌诱导的GSK-3β磷酸化增加的作用被LY-294002而不是Rapamycin及Chelerythrine所抑制,锌能够明显增加Akt而不是mTOR的磷酸化水平,提示PI3K/Akt而不是mTOR或PKC参与锌的作用。进一步的研究显示,锌能够明显增加线粒体GSK-3β磷酸化水平,表明线粒体参与锌的作用。锌诱导的线粒体GSK-3β磷酸化增强的作用没有被线粒体ATP敏感性钾离子通道(mK_ATP)抑制剂5-HD所阻断,表明mK_ATP不参与锌诱导的线粒体GSK-3β磷酸化过程。在H₉C₂细胞缺血/再灌注模型中,锌能够明显减轻再灌注时细胞死亡,表明锌能防止再灌注损伤。为了进一步探讨GSK-3β是否在其中发挥作用,利用持续激活型GSK-3β质粒DNA（GSK-3β-S9A-HA,不受GSK-3β上游激酶下调而持续激活）转染了细胞。结果显示,在转染了这种质粒的细胞中,锌不能减轻再灌注损伤。用持续抑制型GSK-3β（GSK-3β-KM-HA）转染细胞后,细胞死亡率也明显降低,提示GSK-3β失活在锌引起的心肌保护中起重要作用。另外,共聚焦显微镜观察显示,锌明显抑制H₂O₂诱导的TMRE荧光减少,而在GSK-3β-S9A-HA转染细胞中锌的这种作用消失,表明锌通过抑制GSK-3β活性而阻止mPTP的开放。小结:（1）外源性锌可抑制H₉C₂心肌细胞中GSK-3β的活性,PI3K/Akt信号途径可能介导锌的这种作用。（2）锌通过使GSK-3β失活而阻止mPTP开放,从而减轻再灌注损伤。