环糊精（Cyclodextrins,CDs）是由α-1,4糖苷键连接的葡萄糖吡喃糖单元组成的环状低聚糖,常见的环糊精有α-、β-和γ-环糊精。环糊精具有亲水的外部表面和疏水的内部空腔,能与许多客体分子形成包合物进而改变其物理或化学性质,因此可作为药物载体以及增溶剂应用于食品、医药等领域。α-环糊精具有较小的内部空腔和较高的抗酶解性,可作为可溶性膳食纤维应用于食品行业中,但α-环糊精产量低价格高,严重限制了其在食品行业的应用。环糊精主要是以淀粉或淀粉衍生物为底物,通过环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase）催化环化反应而成。此外,CGTase还可催化水解反应、歧化反应和偶联反应。CGTase生产环糊精的能力主要与其环化/水解活性比值及环化产物特异性有关。本研究以表达量高且稳定性好的Bacillus stearothermophilus NO2 CGTase为研究对象,通过定点突变对其进行分子改造,获得环化/水解比和产物特异性提高的优势突变体,最终提高环糊精总转化率及α-环糊精产物比率。主要结果如下:（1）基于E142位点的分子改造提高CGTase产物特异性。通过序列比对和-7亚位点结构分析,选择位于-7亚位点的E142氨基酸残基作为突变位点并构建突变体E142P。该突变体的β-环糊精合成活性从野生型的337.79 U·mg-1降低到183.16 U·mg-1,α-环糊精合成活性与β-环糊精合成活性的比值从野生型的1.14提高到1.98。在以可溶性淀粉为底物制备α-环糊精时,突变体E142P的α-环糊精产物占比率从野生型的38.05%提高到47.70%。结构分析表明该突变体破坏了E142氨基酸残基与-7亚位点处糖单元间的氢键相互作用,从而提高α-环糊精产物特异性,有利于α-环糊精的制备。（2）基于N353和L277位点的分子改造提高CGTase反应特异性。通过多重序列比对和-1/+1亚位点附近疏水簇结构分析,选择位于+2亚位点的N353氨基酸残基作为突变位点并构建突变体N353A。同时选择了本实验室前期设计并构建的位于+1亚位点的L277A、L277I、L277M以及L277F突变体进行研究。结果表明,突变体N353A、L277M和L277F的环化/水解比提升,分别是野生型的3.25倍、1.91倍和2.62倍,有利于减少α-环糊精制备过程中麦芽寡糖的生成量,从而降低偶联反应对α-环糊精的降解作用。进一步将它们与突变体E142P进行组合,获得组合突变体E142P/N353A。酶转化结果显示,α-环糊精产物占比率相较野生型提高了15.62%,说明该突变体具有提高CGTase环化/水解比和提高α-环糊精产物特异性的双重作用,说明E142P和N353A具有协同作用。结构分析表明突变体N353A影响催化氨基酸残基E253附近的电荷平衡,导致E253与亲核氨基酸残基D225之间的距离变大,从而具有提高环化/水解活性比值的作用。（3）CGTase在Bacillus subtilis中的重组表达及重组酶制备α-环糊精的工艺优化。以p HY300PLK为表达载体,构建含有启动子Pamy E和信号肽SP1的重组质粒p HY300PLK-Pamy E-SP1-E142P/N353A,并转化至宿主菌B.subtilis WS9。重组菌摇瓶发酵后的胞外酶活为16.60 U·m L-1,3-L罐发酵培养后的胞外酶活为110.03 U·m L-1;以15%(w·v-1)的马铃薯淀粉为底物,对突变体E142P/N353A制备α-环糊精的酶转化工艺进行了优化。获得的最佳酶转化条件为:反应温度为50℃、反应p H为5.5,添加48 U·g-1底物的异淀粉酶、5 U·g-1底物的CGTase和5%(v·v-1)的癸醇。在该条件下,环糊精总转化率为61.08%,α-环糊精产物占比率为80.05%。