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哺乳动物卵巢组织内有大量处于休眠状态的原始卵泡,但目前对这部分卵泡的利用率却很小本研究旨在用组织学,免疫组化(细胞核增殖抗原检测和细胞凋亡检测),透射电镜观察以及对培养液中雌激素,妊娠,抑制素的测定等手段,对不同生理状态绵羊卵巢组织生理结构,影响体外培养效果的基础条件,以及抗坏血酸,促卵泡素,表皮生长因子,碱性成纤维生长因子,生长分化因子-9对绵羊卵巢组织体外培养的影响,做系统的研究。在这些研究的基础上以动态连续添加多种成分的方式,建立了可供绵羊皮质卵泡发育到窦腔阶段的综合培养体系,此外还对绵羊卵巢组织的玻璃化冷冻进行了对比研究,建立了适合绵羊卵巢组织快速冷冻的方法,主要取得了以下结果：1、通过对绵羊各阶段卵巢的生理构造研究发现,卵巢中原始卵泡位于皮质的最外层,紧靠白膜下方,密度较大,而发育卵泡位于皮质里层。青年母羊卵巢内发育程度较高,各级卵泡直径都较大,老龄母羊中闭锁卵泡增多,而胎儿和羔羊卵巢中原始卵泡数量较多,直径较小,且构成相对单一。有黄体卵巢中原始卵泡比例低于无黄体卵巢,而次级卵泡比例高于无黄体卵巢。左侧卵巢原始卵泡数量高于右侧卵巢。2、通过对各种培养条件的对比研究,发现绵羊卵巢卵泡在金属格栅+3mg/ml的胶原蛋白,以100μl/cm2的密度铺层的滤膜或膜硝酸纤维素膜的培养支架上,以α-MEM+3mg/mlBSA+胰岛素10μg/ml+转铁蛋白6.25μg/ml+亚硒酸钠6.25ng/ml+0.23 mM丙酮酸钠+2 mM谷氨酰胺+2mM次黄嘌呤+100IU/ml双抗为基础培养液,在38.6℃,5%CO2的增湿培养箱中能长期存活与发育。3、培养中添加50ng/mlVC,能维持卵泡存活和卵泡结构完整。50ng/mlFSH能够促进卵泡和卵母细胞直径的增长,动态添加FSH能促进绵羊原始卵泡在体外的发育和存活,促进卵泡雌激素的分泌和颗粒细胞增殖。添加100ng/mlEGF促进原始卵泡发育和存活,高浓度EGF添加对绵羊卵泡体外发育不利；bFGF呈剂量依赖性促进绵羊原始卵泡的体外发育和生长,培养21天后显著的提高次级卵泡的比例,以及雌激素的分泌；200ng/mlGDF-9显著的促进初级卵泡向次级卵泡的转变,促进颗粒细胞增殖,维持卵泡存活。4、通过对对各种因子的不同组合添加发现,FSH与EGF或VC共同作用可以促进羊原始卵泡的激活和生长,VC与EGF一起时则抑制卵泡的发育和生长,FSH可以消除这种抑制,且增强它们对细胞增殖活性的影响bFGF,GDF-9,EGF,FSH以及VC之间存在着相互促进作用,共同作用能促进卵泡的存活和发育。在添加有VC,BSA,ITS等的α-MEM培养液中,动态连续添加起始高浓度的bFGF和GDF-9以及起始低浓度的EGF和FSH培养18天后,能有效的支持羔羊皮质内卵泡大量启动发育到次级阶段甚至窦腔阶段,促进颗粒细胞增殖,抑制间质细胞凋亡,促进雌激素和抑制素的分泌。5、通过对卵巢组织常规短期保存和冷冻保存研究发现,卵巢组织在生理盐水和α-MEM中4。C保存2小时,或者20℃保存2-6小时不影响卵泡的后续发育潜力。以20%DMSO+20%EG作为冷冻保护剂,梯度平衡后,用金属固体表面玻璃化冷冻方法冷冻绵羊卵巢组织,对卵泡的后续发育和卵巢活性的保持没有影响。