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番茄(Solanum lycopersicum)在我国保护地蔬菜栽培中占有重要地位,经济效益较高,但番茄属喜温蔬菜,不耐低温冻害。因此,采取一定措施提高番茄的耐低温性有着重要的现实意义。光敏色素互作因子PIFs参与植物的多个生长发育过程,不仅在光温信号转导中起关键作用,还通过参与多种激素的合成和信号转导调控植物的逆境响应。有研究报道,GAs信号途径中的负调控子DELLAs通过与PIF4和PIF3互作抑制植株的下胚轴伸长,但是否参与调控植株的低温耐受性仍需探索。本文选用番茄为试验材料,运用分子生物学、植物生理学等技术研究了番茄光敏色素互作因子PIF4在光质调控番茄低温抗性中的作用;明确了PIF4通过调控CBFs抗冷途径相关基因及植物激素合成,提高植物的耐低温性;探明了 PIF4转录调控CBF1及DELLA蛋白编码基因GAI4的作用机制。主要内容如下:1.研究了光敏色素互作因子PIF4在番茄低温响应中的作用。低温分别抑制和诱导感受红光(R)和远红光(FR)的光敏色素PHYB和PHYA的编码基因PHYB和PHYA的表达。低温和FR不仅诱导光敏色素互作因子PIF4的基因表达,而且增强PIF4蛋白的稳定性。低温下,phyA和phyAB1B2突变体中的PIF4表达量下降,而phyB1B2突变体中的PIF4转录水平上调。与野生型相比,PIF4突变后,番茄的低温抗性下降,而其过表达植株中的低温抗性明显提高。这说明PIF4正调控番茄的低温抗性。进一步研究发现,低温下,PIF4一方面通过直接结合到CBF1的启动子上促进其转录提高番茄的低温抗性。另一方面,PIF4通过促进ABA和JA合成基因的表达诱导植物激素ABA和JA的累积,同时抑制GAs合成基因的表达降低GAs含量,进而调控番茄的低温抗性。以上结果表明,低温下FR通过phyA促进PIF4的积累,转录因子PIF4通过转录调控CBF1及诱导ABA和JA的合成并抑制GAs的合成,从而提高番茄植株的低温抗性。2.明确了 PIF4与GAI4在光质调控番茄低温抗性中的相互作用。光敏色素互作因子PIF4是联结光信号和激素信号的关键枢纽,但低温下PIF4和GAs信号途径的负调控基因GAI4的相互作用关系尚不明确。研究发现,低温下,pif4突变体中GA含量上升,GAI4表达量明显下调。利用凝胶电泳迁移实验(EMSA)、双荧光素酶报告基因系统和染色质免疫共沉淀实验(ChIP),发现低温下PIF4结合到GAI4基因的启动子上促进其表达,这说明PIF4低温下正调控GAI4的表达。3.明确了 GAI4在远红光诱导番茄耐低温性中的作用。研究发现,低温下,沉默GAI4基因后,番茄的光系统II的最大光化学效率(Fv/Fm)显著降低,电导率(REL)显著上升,且抗冷CBF1基因的表达明显下调;而过表达GAI4基因后,其Fv/Fm显著上升、REL明显下降,且CBF1基因表达量上升,这些均说明GAI4正调控番茄的低温抗性。为进一步明确GAI4在FR诱导番茄低温抗性中的作用机制,我们检测了 GAI4沉默及过表达材料中的植物激素ABA与JA。研究发现,低温下,相比于野生型植株(WT),GAI4过表达显著诱导了 ABA与JA的合成与信号基因的表达,同时促进ABA和JA的积累;而沉默GAI4基因则严重削弱了这种诱导作用。这说明GAI4正调控ABA与JA信号传导通路。通过在番茄WT和ABA缺失突变体not植株上外源喷施GA3及其抑制剂PAC,发现ABA信号是在GAs信号的下游起作用。综上可知,GAI4基因通过CBFs和ABA、JA激素途径正调控FR诱导的番茄低温抗性。4.明确了低温下,GAI4反馈抑制PIF4。通过在番茄WT、pif4突变体和PIF4过表达植株上外源喷施GA3及其抑制剂PAC,发现外源喷施GA3明显抑制番茄的低温抗性,而PAC促进番茄的低温抗性。另外,低温下,外源喷施PAC明显抑制了 PIF4蛋白的积累,且过表达GAI4基因后,PIF4蛋白也有所减少;相反,沉默GAI4基因后,PIF4蛋白显著积累。这说明低温下,GAI4反馈抑制PIF4。这样PIF4-GAI4形成一个反馈调节环,精细地调控番茄的低温抗性。