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目的:本研究以MAPKs信号转导通路为主要线索,通过制备大鼠含药血清、培养大鼠肾上腺髓质嗜络细胞瘤细胞(PC12细胞),观察并验证补肾健脑汤对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有保护作用,以MAPKs信号转导通路和炎症反应为切入点,从分子生物角度揭示补肾健脑汤对神经细胞损伤的预防保护作用机制,为补肾健脑汤能够缓解阿尔茨海默病的病程提供有效的科学依据,为临床药物的开发奠定基础。材料与方法:第一部分,制备大鼠含药血清:将健康SD大鼠随机分为8组:空白组,模型组、高剂量组,中剂量组,低剂量组,中药高剂量+p38抑制剂组,中药高剂量+ERK抑制剂组,中药高剂量+JNK抑制剂组,每组5只大鼠。8组大鼠同时在相同环境下饲养,定时早晚喂食,饮水不限,于饲养第二天上午开始灌胃给药。按照成人临床每日剂量乘以大鼠用药系数0.018,计算得中药高剂量组(包含抑制剂组)给药浓度为14.4g(Kg/天):中剂量组给药浓度7.2g(Kg/天):低剂量组给药浓度为3.6g(Kg/天),连续5天给药。空白组及模型组不予特殊处理,常规喂养5天。中药各剂量组除含药浓度不同,其余均相同。于末次给药1h后,进行腹腔麻醉,在腹主动脉抽血,3000转离心10min分离得到血清,56℃灭活30min,无菌过滤,即为含药血清。放入4℃冰箱中保存待用。第二部分,细胞实验:用37℃水浴中迅速融化冻存的PC12细胞,离心,弃去废液,放入含10%FBS的DMEM培养基重悬,在培养瓶中接种,放置于5%CO2、37℃培养箱中培养24h,2~3d换液一次。细胞完全融合后,弃去废液,在倒置显微镜下观察并计数,按照105cells/ml的密度在新的培养瓶接种,最后放入CO2恒温培养箱中培养。根据实验要求,将PC12细胞分为以下五组(1)空白组:(用事先准备好的空白组大鼠血清培养24h),(2)模型组:(同时加入模型组大鼠血清和终浓度为20μmol/L的Aβ25-35共培养24h)(3)中药低剂量组:(分别用终浓度为20μmol/L的Aβ25-35和含有低剂量的补肾健脑汤的含药血清培养24h)(4)中药中剂量组:(分别用终浓度为20μmol/L的Aβ25-35和含有中剂量的补肾健脑汤的含药血清培养24h)(5)中药高剂量组:(分别用终浓度为20μmol/L的Aβ25-35和含有高剂量的补肾健脑汤的含药血清培养24h)以上中药高、中、低剂量组(分别用终浓度为20μmol/L的Aβ25-35和含有浓度为高,中、低的补肾健脑汤的含药血清培养24h)。所有细胞均培养在37℃、5%二氧化碳的培养箱中。用ELISA法测定白细胞介素-8(IL-8)含量、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量和核因子-КB(NF-КB)。用PCR检测细胞中AKT、Nrf2的m RNA水平。结果:⒈补肾健脑汤含药血清能够保护Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞2.补肾健脑汤对PC12细胞AKt/Nrf2mRNA表达量的影响高剂量组AKtm RNA表达量最高,模型组中AKtm RNA表达量最低,相对于空白对照组,AKtm RNA的表达量明显降低;高、高剂量+抑制剂组比模型组的细胞中AKtm RNA表达量高,AKtm RNA表达量在高剂量组细胞中比中剂量组和低剂量组高;高、高剂量+抑制剂组细胞中AKtm RNA表达量与中剂量组比较明显升高模型组中Nrf2m RNA表达量最低,高剂量组+抑制剂组细胞Nrf2m RNA表达量最高。与空白对照组比较,模型组Nrf2m RNA表达量显著降低。高、中、低、高剂量+抑制剂组比模型组细胞中Nrf2m RNA表达量显著升高。同低剂量组比较,中、高剂量、高剂量+抑制剂组中Nrf2m RNA表达量显著升高。与中剂量比较,高剂量、高剂量+抑制剂组中Nrf2m RNA表达量显著升高。高剂量+抑制剂组细胞中Nrf2m RNA表达量显著高于高剂量组。3.补肾健脑汤含药血清对Aβ25-35诱导的PC12细胞白细胞介素-6(IL-6)含量的影响五个模型中,高剂量+抑制剂组白介素6表达量最低,模型组白介素6表达量最高。与空白对照组比较,五个模型组白介素6的表达量明显升高。高、中、低、高+抑制剂组细胞中白介素6比模型组表达量低;高剂量+抑制剂组与低、中剂量组相比较,细胞中白介素6表达量显著减少。4.补肾健脑汤含药血清对Aβ25-35诱导的PC12细胞白细胞介素-8(IL-8)含量的影响五个模型中,高剂量+抑制剂组白介素8表达量最低,模型组白介素8表达量最高。低、中、高剂量组白介素8表达量同空白对照组比较,明显上升;低、中、高剂量、高剂量+抑制剂组细胞中白介素8表达量与模型组比较,明显下降;低、中、高剂量组与高剂量+抑制剂组相比较,细胞中白介素8表达量显著降低。5.补肾健脑汤含药血清对Aβ25-35诱导的PC12细胞白细胞介素1β(IL-1β)含量影响五个模型中,高剂量+抑制剂组白介素1β表达量最低,模型组白介素1β表达量最高。低、中、高剂量、高剂量+抑制剂组与空白对照组比较,白介素1β表达量明显上升,但是与模型组比较,各组细胞中白介素1β表达量显著下降;高剂量+抑制剂组与低、中、高剂量组相比较,细胞中白介素1β表达量明显减少。6.补肾健脑汤含药血清对Aβ25-35诱导的PC12细胞核因子-КB(NF-КB)含量的影响五个模型中,高剂量+抑制剂组NF-KB-1表达量最低,模型组白介素NF-KB-1表达量最高。与空白对照组比较,低、中、高剂量、高+抑制剂组NF-KB-1表达量明显上升。低、中、高剂量、高+抑制剂组细胞中NF-KB-1比模型组的表达量低。结论:⒈补肾健脑汤含药血清能够保护Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞。2.补肾健脑汤激活AKt/Nrf2信号通路,AKt/Nrf2m RNA表达量升高,可以抑制促炎细胞因子的表达,从而起到抗炎抗神经细胞凋亡作用。3.补肾健脑汤含药血清对Aβ25-35诱导损伤的PC12细胞起到保护作用,其作用机制可能是通过降低PC12细胞白细胞介素-8(IL-8)含量、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量,降低Aβ的毒性作用,减少对炎症因子对神经造成的损伤。4.补肾健脑汤含药血清能抑制核因子-КB(NF-КB)表达,提示补肾健脑汤对Aβ25-35诱导的PC12细胞的保护作用可能存在NF-КB信号通路的参与。