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Part One.甘草黄酮对肺部炎症小鼠细胞因子表达和氧化反应的调节作用甘草系豆科多年生草本植物,主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等化学成分。甘草黄酮具有广泛的药理活性,包括抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、抗溃疡、保肝等作用。前期的研究证明甘草黄酮对辣椒素引起的豚鼠咳嗽反射有很强的抑制作用,我们推测其镇咳作用机制与抗炎效应有关。甘草黄酮对肺部炎症的实验研究至今未见报道,本研究采用内毒素脂多糖诱导的小鼠肺部炎症模型探讨甘草黄酮的抗炎作用,并初步研究其抗炎作用机制。1对支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数和中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数的影响小鼠气道内滴入LPS 24 h后,模型组BALF中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目显著上升。白细胞总数和中性粒细胞与对照组比较分别增加了8.6倍和515倍（P＜0.001）,淋巴细胞和巨噬细胞与对照组比较也有明显差异（P＜0.01）。与LPS（模型）组比较,甘草黄酮3、10、30 mg·kg-1+LPS组和DXM 1 mg·kg-1+LPS组均能显著抑制BALF中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数目显著增加。2对肺水含量的影响对照组肺水含量为32.95±3.27%,模型组为39.48±2.06%,与对照组比较（P＜0.01）;甘草黄酮3 mg·kg-1组为36.25±2.74%,与模型组比较（P＜0.05）;10 mg·kg-1组为36.77±1.83%（P＜0.05）;30 mg·kg-1组为35.06±4.61%（P＜0.05）;DXM 1 mg·kg-1为33.47±4.51%（P＜0.01）。3对BALF中中性粒细胞髓过氧化酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量的影响小鼠气道内滴入LPS24h后,模型组BALF中的SOD活力单位明显下降,肺组织中的MPO活力单位明显升高（P＜0.05）。与LPS（模型）组比较,甘草黄酮3、10、30 mg·kg-1+LPS组和DXM 1 mg·kg-1+LPS组均能显著提高BALF中的SOD活力单位,显著减少肺组织中的MPO活力单位。4对肺组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA和白介素-1β（IL-1β）mRNA表达影响小鼠气道内滴入LPS 6h或24h后取肺组织,匀浆后测定TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达。滴入LPS 6h的TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达水平高于24 h。滴入LPS 6h的TNF-αmRNA与对照组比较有明显差异（P＜0.01）,24 h的TNF-αmRNA与对照组比较无明显差异（P＞0.05）。滴入LPS 6h或24h的IL-1βmRNA表达与对照组比较均有明显差异（P＜0.05）。甘草黄酮30 mg·kg-1能明显抑制滴入LPS 6h或24 h的IL-1βmRNA表达（P＜0.05）,也能明显抑制滴入LPS 6h的TNF-αmRNA表达（P＜0.01）,但对24 h的TNF-αmRNA表达无作用。DXM 1mg·kg-1仅对6 h的TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达有明显作用（P＜0.05）,对24 h的两个细胞因子表达均无明显影响。5对LPS气管内滴入2小时后的肺组织和BALF中TNF-α蛋白水平上升的抑制作用小鼠气道内滴入LPS2h后支气管肺泡灌洗和取肺组织,离心和匀浆后用ELIESA法测定TNF-α蛋白水平。结果显示滴入LPS 2h的TNF-α蛋白水平与对照组比较有明显差异（P＜0.001）。甘草黄酮10、30 mg·kg-1能明显抑制滴入LPS2h TNF-α蛋白水平,阳性对照药地塞米松1 mg·kg-1也有明显抑制作用。6对肺组织病理变化的影响气道内滴入LPS 24 h后,模型组小鼠肺组织间隙可见大量的红细胞渗出和中性粒细胞浸润,肺泡破坏严重,肺泡间隙结构增宽,有透明膜存在,水肿现象明显。甘草黄酮10、30mg·kg-1和DXM 1 mg·kg-1能明显改善这些病理变化,甘草黄酮1 mg·kg-1作用不明显。7结论甘草黄酮能改善LPS引起的小鼠肺部炎症,其抗炎作用可能与抑制细胞因子的表达和调节氧化/抗氧化反应有关。Part Two.甘草黄酮、甘草苷芹糖对CSE诱导人小气道上皮细胞株NCI-H292细胞毒反应、IL-8mRNA和MUC5AC mRNA表达的影响在第一部分研究中,我们已经证明了甘草黄酮能改善LPS引起的小鼠肺部炎症,其抗炎作用可能与抑制细胞因子的表达和调节氧化/抗氧化反应有关。在第二部分研究中,我们首先想证明甘草黄酮和甘草黄酮中进一步纯化获得的甘草苷芹糖是否有对抗香烟燃烧后的提取物（CSE）诱导的肺上皮细胞的细胞毒作用;其次探索能否调节CSE诱导的肺上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA表达和白介素8（IL-8）mRNA表达。实验方法采用噻唑蓝（MTT）比色法测定CSE、药物及CSE和药物联用对细胞增殖的影响,用RT-PCR检测MUC5AC mRNA和IL-8 mRNA的表达。1.CSE诱导NCI-H292、A549和HCC-827细胞毒反应CSE呈浓度依赖诱导NCI-H292、A549和HCC-827细胞毒反应和减少细胞的存活率。在三个细胞株中,CSE对NCI-H292细胞株最敏感。此外,该细胞株为人小气道上皮细胞株,在传代生长过程增殖较快。2.CSE诱导NCI-H292细胞毒反应的时效和量效关系CSE 1.25%～10.0%呈浓度依赖诱导NCI-H292细胞死亡,在培养的24～72小时之间,随时间的延长细胞死亡率增加。3.甘草黄酮（LF）对NCI-H292细胞存活率的影响LF（0.005～5μg/ml）对NCI-H292细胞存活率无明显影响。4.甘草苷芹糖（LA）对NCI-H292细胞存活率的影响低浓度LA(10-10～10-6M)对NCI-H292细胞存活率无明显影响。当LA浓度达到10-5～10-4M培养24h时,可见明显的细胞毒作用。继续培养24h或48h,这种细胞毒作用渐退,可见高浓度LA的细胞毒作用是轻度和可恢复的。5.甘草黄酮（LF）对CSE诱导NCI-H292细胞毒的保护作用LF（5μg/ml）对CSE诱导NCI-H292细胞毒有明显的保护作用,但当LF浓度在0.005～0.5μg/ml时无明显作用。6.甘草苷芹糖（LA）对CSE诱导NCI-H292细胞毒的影响当LA浓度达到10-7～10-6M时,可明显增强CSE诱导的细胞毒反应（P＜0.05～0.01）。当LA浓度在1010～10-8M时,对CSE诱导的细胞毒反应不明显（P＞0.05）7.CSE诱导NCI-H292细胞IL-8和MUC5AC mRNA表达的时效和量效关系2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞6h和24h可明显诱导IL-8mRNA表达（P＜0.05～0.01）,而1.25%CSE暴露NCI-H292细胞24h不能明显诱导IL-8mRNA表达,2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞1h和3h也不能明显诱导IL-8mRNA表达,提示CSE诱导NCI-H292细胞IL-8 mRNA表达呈时效和量效关系。同样,2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞24h可明显诱导MUC5AC mRNA表达（P＜0.05）,而1.25%CSE暴露NCI-H292细胞24h不能明显诱导MUC5AC mRNA表达,2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞1h、3h和6h也不能明显诱导IL-8mRNA表达,提示CSE诱导NCI-H292细胞MUC5AC mRNA表达呈时效和量效关系。8.LF对CSE诱导NCI-H292细胞IL-8 mRNA和MUC5AC mRNA表达的影响2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞24h可明显诱导IL-8mRNA表达（P＜0.01）,LF 0.5和5μg/ml预处理,与不处理的样本比较,显示明显的抑制作用（P＜0.05）,阳性对照地塞米松1μM处理后显示很强的抑制作用（P＜0.05）。同样,LF 0.5μg/ml预处理,与不处理的样本比较,对2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞24h诱导的MUC5AC mRNA表达显示明显的抑制作用（P＜0.05）。9.LA对CSE诱导NCI-H292细胞IL-8 mRNA和MUC5AC mRNA表达的影响2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞24h可明显诱导IL-8mRNA表达（P＜0.05）,LA 1和10μM预处理,与不处理的样本比较,无明显的抑制作用（P＞0.05）。同样,LA1和10μM预处理,与不处理的样本比较,对2.5%CSE浓度暴露NCI-H292细胞24h诱导的MUC5AC mRNA表达也没有显示明显的抑制作用（P＞0.05）。10.结论这些结果显示NCI-H292是一个较好的研究CSE诱导上皮细胞炎症机制的模型。甘草黄酮（LF）能减轻CSE诱导上皮细胞细胞毒反应,抑制CSE诱导上皮细胞表达IL-8和MUC5ACmRNA,甘草苷芹糖则无明显作用。