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灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲多孔菌目灵芝属真菌,始记于《神农本草经》,被列为上品,是传统名贵药材。现代药理研究表明灵芝具有抗肿瘤,调节血压,延缓衰老,免疫调节等多种功效。灵芝被誉为“生物活性化合物的细胞工厂”,目前已经从灵芝中分离得到大约400多种具有生物活性的化合物。本研究通过基因组分析发现已测序的三个灵芝属真菌编码丰富的萜类合酶(TPS)基因,其中赤芝(G. lucidum)编码23个TPS,紫芝(G. sinense)和G.sp各编码26个TPS。系统进化分析发现灵芝属TPS在进化树上可以分为3个分枝,同一分枝中TPS基因的外显子模式和内含子相位都具有很强的相似性。结合基因在染色体上的位置分析发现,基因复制是灵芝属TPS家族扩张的主要原因。利用实时荧光定量RT-PCR方法分析赤芝在菌丝、原基和子实体三个不同发育阶段中23个TPS基因的表达变化,其中12个TPS在菌丝中表达量最高,4个在原基期表达量最高,7个在子实体中表达量最高,说明在赤芝不同发育阶段中TPS的表达是受到严格调控的。利用固相微萃取技术收集不同培养时间的赤芝菌丝产生的可挥发性物质,并利用GC/MS进行检测,发现菌丝从第4天开始产生倍半萜类物质,至第18天时产生的倍半萜类物质累计共计13种,每天产生倍半萜的种类最多可达7种。其中大多数倍半萜为首次在赤芝中被报道。利用RT-PCR技术扩增到21个TPS的全长cDNA,对于未获得全长cDNA的两个TPS基因,根据预测基因阅读框采用全化学合成的方法获得。将23个基因在大肠杆菌中进行异源表达,SDS-PAGE分析发现22个蛋白具有可溶蛋白形式。利用固相微萃取柱收集催化产物并进行GC/MS分析发现,其中15个TPS可以分别合成1-5种倍半萜,所有TPS共累计生成17种不同的倍半萜。对赤芝的TPS进行蛋白序列比对和分析,发现14个TPS含有两个保守基序DDXX(D,E)和(N,D)DXX(S,T)XXXE,而另外9个TPS仅含有(N,D)DXX(S,T)XXXE一个基序,前者聚类到进化树的分枝Ⅰ和Ⅲ,后者属于分枝Ⅱ。进化分枝Ⅰ和Ⅲ的TPS主要产生含两个六元环的倍半萜,其合成过程先后经历了1,10和1,6闭环反应。进化分枝Ⅱ的TPS产物结构更加多元化,部分产物合成过程中具有1,7闭环反应,这是一种比较罕见的倍半萜合成机制,可能与分枝Ⅱ的TPS缺失DDXX(D,E)基序有关。本研究利用全基因组搜索快速、准确而全面地发掘赤芝中所有的倍半萜合酶基因,进而通过异源表达和酶活性检测的策略对赤芝倍半萜组(sesquiterpenome)进行研究,发现多种未在灵芝中报道过的倍半萜物质,表明全基因组测序和异源表达相结合是解析药用植物活性成分生物合成途径的有效方法。同时,赤芝TPS产物多样性及其催化机制研究将为通过酶工程与或合成生物学方法优化和设计TPS,提高其催化产物的产量或生产全新的“非天然”天然产物奠定基础,从而推动天然产物类新药的研发。