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固有免疫是机体抵御感染的第一道防线,多种信号通路参与调节,其中c GAS/STING介导的I型干扰素产生通路就是其中一个经典通路。c GAS作为胞质感受器能够被来源于病毒或细菌的DNA启动活化,通过激活STING触发下游级联反应产生I型干扰素（IFN-I）和相关细胞因子发挥抗感染作用。其中IFN-I主要包括IFN-α和IFN-β,在抗病毒和胞内菌感染方面均具有重要作用。乳酸菌作为肠道菌群的重要组成成员可通过多种机制调节机体固有免疫反应。近年来有研究发现某些乳酸菌菌株能够激活STING或MAVS介导的IFN-I产生通路,进而发挥抗感染作用。然而乳酸菌的这种调节作用在抗病毒或胞内菌（感染）方面的确切机制尚未揭示清楚。为此,本实验以前期从仔猪肠道筛选获得的猪源植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,LP）为研究基础,研究了LP对猪肠上皮细胞（IPEC-J2）中STING的调节作用;以严重危害仔猪肠道健康的重要病原-猪轮状病毒和鼠伤寒沙门菌（胞内致病菌）为研究对象,揭示了LP调控STING介导猪肠上皮细胞抗感染作用的潜在机制。旨在为乳酸菌调节宿主固有免疫抗胞内病原感染研究奠定基础。1.植物乳杆菌对猪肠上皮细胞c GAS-STING通路的影响为确定LP与猪肠上皮细胞IPEC-J2共培养最佳感染复数与孵育时间,本实验通过CCK-8法和流式细胞术,比较LP与IPEC-J2细胞在不同感染复数（MOI=10、100）和不同共培养时间（1 h、4 h和6 h）下,LP对细胞增殖和凋亡的影响。利用荧光显微镜和平板计数法,分析LP对IPEC-J2细胞的黏附效果。结果显示,LP对IPEC-J2细胞活力和凋亡均未产生不良影响,在MOI=100、共培养6 h条件下,LP与IPEC-J2细胞黏附效果较好。为进一步明确LP介导STING对猪肠上皮细胞IFN-Ⅰ通路的影响。本试验采用ELISA和荧光定量PCR（RT-q PCR）法检测了细胞培养上清中IFN-β、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平以及细胞内IFN-β的转录水平,Western blot法检测c GAS-STING通路中STING和IRF3的磷酸化水平。结果显示,LP与IPEC-J2细胞共培养上清IFN-β的分泌水平（p＜0.01）和胞内IFN-β的转录水平均显著高于对照组（p＜0.05）;共培养上清TNF-α和IL-6的分泌水平也显著上调（p＜0.01）,与共培养时间呈正相关性,IL-1β的分泌水平有上升趋势但差异不显著（p＞0.05）。LP干预后的IPEC-J2细胞中磷酸化STING和IRF3的表达水平明显增多（p＜0.01）,表明LP能介导STING促进IPEC-J2细胞产生IFN-β。2.c GAS/STING通路对植物乳杆菌调控猪肠上皮细胞抑制Po RV复制的影响将LP与IPEC-J2细胞以MOI=100比例共培养6 h后,接种0.5 TCID50/cell的Po RV 12h（LP+Po RV组）、同时设立LP处理后不感染Po RV处理（LP组）、仅感染Po RV,不加LP预处理（Po RV组）、空白对照（CON组）,采用TCID50法和RT-q PCR法对各组病毒滴度和病毒NSP4基因拷贝数进行测定。结果显示,LP+Po RV组Po RV的病毒滴度显著低于Po RV组（p＜0.05）,LP+Po RV组病毒拷贝数显著低于Po RV组（p＜0.001）。提示LP能够抑制Po RV在IPEC-J2细胞中的复制。值得注意的是,LP+Po RV组IFN-β的转录与表达水平均显著高于Po RV组（p＜0.05）。暗示了LP或许是通过促进IPEC-J2细胞产生IFN-β达到抑制Po RV的效果。为明确IFN-β产生是否由STING通路介导,采用Western blot检测了该通路中的两个关键蛋白STING和IRF3磷酸化表达水平,结果显示,LP+Po RV组STING蛋白磷酸化水平显著高于LP组、Po RV组及CON组（p＜0.05）,并且LP组和Po RV组STING蛋白磷酸化水平也显著高于CON组（p＜0.05）;LP+Po RV组IRF3蛋白磷酸化水平显著高于LP组和CON组（p＜0.05）,略高于Po RV组,但差异不显著（p＞0.05）,这表明LP干预后再感染Po RV会增强STING活化。鉴于IFN-β会进一步促进干扰素刺激基因（ISGs）的表达,采用RT-q PCR法检测了ISGs的代表基因IFIT2、CXCL10和ISG15的转录水平,结果显示,LP+Po RV组IFIT2、CXCL10和ISG15基因转录水平均显著高于LP组和Po RV组（p＜0.05）。由此推测LP可能是通过活化STING通路诱导IPEC-J2细胞产生IFN-β从而抑制轮状病毒复制。为明确STING是否在其中发挥关键作用,本试验利用STING共价抑制剂C-170进行阻断实验。结果显示,C-170阻断后的各组IFN-β的表达水平和转录水平均显著下降（p＜0.05）,IRF3蛋白磷酸化水平显著降低（p＜0.05）,干扰素刺激基因IFIT2、CXCL10和ISG15的转录水平均明显受到抑制（p＜0.05）,添加C-170后的LP+Po RV组病毒滴度和病毒拷贝数与Po RV组无显著差异（p＞0.05）;表明STING在LP调控IPEC-J2细胞抑制Po RV复制中发挥关键作用,LP调控IPEC-J2细胞抗Po RV感染依赖于STING-IRF3-IFN-β途径。3.c GAS/STING通路对植物乳杆菌调控猪肠上皮细胞干扰鼠伤寒沙门菌黏附与侵入的影响LP与IPEC-J2细胞共培养1 h后,分别设置感染鼠伤寒沙门菌（S.Tyhimurium,ST）1 h（LP+ST组）、不感染ST（LP组）、ST单感染（ST组）和空白对照（CON组）,通过排斥（LP先于ST刺激IPEC-J2细胞）、竞争（LP与ST同时刺激IPEC-J2细胞）和置换实验（LP晚于ST刺激IPEC-J2细胞）实验,评价了LP对ST黏附和侵入IPEC-J2细胞的影响。排斥实验结果显示LP+ST组显著低于ST组（p＜0.05）,竞争和置换实验LP+ST组与ST组无显著差异,表明LP先于ST刺激IPEC-J2细胞能够更有效地干扰ST的黏附和侵入,对ST感染的抑制效果更好。采用ELISA法检测IPEC-J2细胞分泌细胞因子水平,结果发现,LP+ST组TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的表达水平与ST组相比均显著上升（p＜0.05）。Western blot结果显示,LP+ST组STING蛋白磷酸化水平显著高于CON组（p＜0.05）,但各组间IRF3蛋白磷酸化水平无明显变化（p＞0.05）。说明STING不是通过活化IRF3促进IFN-β产生,推测可能通过促进IκBα的磷酸化激活下游信号产生IFN-β等细胞因子。为此,本实验进一步检测了IκBα磷酸化水平,结果可见,LP+ST组的IκBα蛋白磷酸化表达水平显著高于CON组（p＜0.05）,较LP组和ST组有上调趋势但差异不显著（p＞0.05）。这表明LP可能通过激活STING-IκBα-IFN-β途径介导IPEC-J2细胞发挥抗S.Tyhimurium感染的作用。综上,本研究明确了植物乳杆菌LP能介导STING激活IPEC-J2细胞IFN-Ⅰ信号通路产生IFN-β及下游的干扰素刺激基因,进而抑制Po RV复制和干扰S.Tyhimurium黏附与侵入,初步揭示STING在植物乳杆菌调控猪肠上皮细胞抗感染过程中的作用,为乳酸菌调节固有免疫抗胞内病原感染研究奠定基础。