【摘 要】
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目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染和糖尿病均为世界性的严重公共卫生问题。我们的前期工作发现,HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx上调一种磷脂酶autotaxin（ATX）的表达,增强溶血磷脂酸（LPA）信号转导。新近有研究指出,ATX/LPA信号转导与胰岛素抵抗和机体葡萄糖稳态受损相关。但HBV感染是否通过LPA信号转导影响胰岛素分泌和机体葡萄糖稳态仍不清楚。本文应用HBV反式调节蛋白pre-S2
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目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染和糖尿病均为世界性的严重公共卫生问题。我们的前期工作发现,HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx上调一种磷脂酶autotaxin（ATX）的表达,增强溶血磷脂酸（LPA）信号转导。新近有研究指出,ATX/LPA信号转导与胰岛素抵抗和机体葡萄糖稳态受损相关。但HBV感染是否通过LPA信号转导影响胰岛素分泌和机体葡萄糖稳态仍不清楚。本文应用HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx的小鼠胰岛素分泌细胞NIT稳定转染细胞系和HBV感染小鼠模型研究HBV感染对胰岛素分泌和机体葡萄糖稳态的影响以及LPA在其中的作用。方法:本研究分为细胞模型和动物模型两个方面。细胞模型研究包括:（1）构建HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx慢病毒质粒;（2）pre-S2和HBx慢病毒质粒转染NIT细胞,建立pre-S2、HBx的稳定转染NIT细胞系;（3）pre-S2、HBx的稳定转染NIT细胞系的葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）试验;（4）LPAR的拮抗剂Ki16425对GSIS期间pre-S2、HBx的稳定转染NIT细胞系胰岛素分泌的影响。动物模型研究包括:（1）小鼠尾静脉注射携带1.3拷贝HBV全长基因组的重组8型腺相关病毒（r AAV8-1.3HBV）建立HBV感染小鼠模型;（2）PCR检测小鼠血清HBV DNA;（3）滚环扩增（RCA）联合跨缺口PCR检测肝组织中的共价闭合环状DNA（ccc DNA）,PCR产物连接、转化、阳性克隆鉴定和DNA测序;（4）实验动物腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）,检测各时间点的血糖和血浆胰岛素水平;（5）液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测血浆样品LPA的含量。结果:细胞模型研究结果:（1）PCR鉴定表明构建的HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx慢病毒质粒与设计相符;（2）LV5、LV5-pre-S2以及LV5-HBx的NIT稳定转染细胞稳定表达荧光;（3）pre-S2、HBx的NIT稳定转染细胞系在GSIS试验中胰岛素分泌显著降低（P＜0.01）;（4）外加LPAR拮抗剂Ki16425升高GSIS中pre-S2、HBx的NIT稳定转染细胞系胰岛素分泌（P＜0.01）。动物模型研究结果:（1）PCR检测r AAV8-1.3HBV注射小鼠血清HBV的DNA呈阳性;（2）RCA联合跨缺口PCR检测肝组织中ccc DNA的PCR产物DNA测序表明r AAV8-1.3HBV注射小鼠有肝内HBV感染;（3）HBV感染小鼠血浆LPA为对照组的1.579倍（P＜0.01）;（4）HBV感染小鼠在GTT的15 min时间点血糖显著升高（P＜0.05）。结论:本文的研究建立了HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx的小鼠胰岛素分泌细胞NIT稳定转染细胞系,发现这两种HBV反式调节蛋白下调NIT胰岛素分泌;LPAR拮抗剂Ki16425阻断HBV反式调节蛋白pre-S2和HBx下调NIT胰岛素分泌的作用;建立了HBV感染小鼠模型,发现HBV感染小鼠血浆LPA高于对照;HBV感染小鼠在GTT中血糖显著增高,提示HBV感染损害机体葡萄糖稳态,其作用机制尚待进一步研究。
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