论文部分内容阅读
目的:通过检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)甲基化水平,筛选有助于食管鳞状细胞癌临床诊断的ctDNA甲基化标记物。方法:(1)应用甲基化DNA免疫沉淀测序(Me DIP-seq)技术,检测8例ESCC患者及8例正常对照血浆中ctDNA甲基化水平,筛选甲基化差异表达基因。(2)运用Mass ARRAY DNA甲基化技术检测ESCC组织和癌旁正常食管黏膜上皮组织中BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1基因启动子区Cp G位点的甲基化水平。(3)采用免疫组织化学技术检测113例ESCC组织及106例癌旁正常食管黏膜上皮组织中BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1蛋白的表达,并用Kaplan-Meier法分析ESCC患者生存预后与分子表达之间的关系。(4)运用酶联免疫吸附法(ELISA)进一步验证血清中BMP7、SLC3A2和PLCE1的表达情况。(5)运用ROC曲线及其曲线下面积(AUC)分析BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1基因启动子区的甲基化水平,组织中蛋白表达水平以及血清中的表达水平对ESCC的诊断价值。(6)用YTHDF2 si RNA转染食管癌细胞系(ECA9706和ECA109细胞)后,CCK8和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞周期的改变。(7)应用Graph Pad Prism8和SPSS25.0软件进行数据分析。结果:(1)运用Me DIP-seq在ESCC和正常样本中分别检测到17913和22145个ctDNA甲基化基因,通过差异分析,我们共发现了7672个差异ctDNA甲基化基因,其中在启动子区有690个差异基因,长度集中分布在200-800bp,且在各染色体上均有分布。(2)根据差异倍数,GO及KEGG通路富集分析等,我们初步筛选15个ctDNA甲基化差异基因进行了免疫组织化学验证,其中有5个基因(BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1)的蛋白表达水平在ESCC患者和癌旁正常食管黏膜上皮组织中的差异具有统计学意义。(3)在ESCC组织中,BMP7启动子区Cp G_24.25的甲基化水平明显高于正常对照组织且差异具有统计学意义(P=0.021);YTHDF2启动子区Cp G_10.11、SLC3A2启动子区Cp G_23.24.25.26.27和PLCE1启动子区Cp G_4的甲基化水平明显低于正常对照组织且差异具有统计学意义(P=0.021、P=0.042和P=0.014);而VIRMA启动子区各个Cp G单位之间的差异不具有统计学意义(P均>0.05)。BMP7启动子区Cp G_18和Cp G_24.25甲基化水平诊断ESCC的ROC曲线下面积分别为0.771和0.833,对应的敏感度为66.7%和75.0%,对应的特异度为87.5%和87.5%,BMP7启动子区的两个Cp G单位联合诊断价值更高,ROC曲线下面积为0.896,对应的敏感度和特异度分别为83.3%和87.5%;SLC3A2启动子区Cp G_23.24.25.26.27诊断ESCC的ROC曲线下面积分别为0.631,对应的敏感度和特异度分别为93.1%和33.3%;PLCE1启动子区Cp G_4诊断食管鳞状细胞癌的ROC曲线下面积分别为0.612,对应的敏感度和特异度分别为50.0%和70.7%。(3)BMP7、YTHDF2和PLCE1蛋白主要表达在细胞质中,BMP7蛋白在ESCC组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.001);而YTHDF2和PLCE1在ESCC组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.001);SLC3A2蛋白主要表达在细胞膜,其在ESCC组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.001);VIRMA蛋白主要表达在细胞核,其在ESCC组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.001)。ROC曲线分析BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1蛋白表达水平诊断ESCC的价值,发现这5个分子的蛋白表达水平均具有较高的诊断价值,ROC曲线下面积分别为0.911、0.974、0.983、0.842和0.659,对应的敏感度为78.0%、93.8%、96.3%、77.2%和33.6%,对应的特异度为85.7%、88.4%、97.2%、86.1%和93.0%。Kaplan-Meier分析显示,YTHDF2的高表达与ESCC患者生存预后差相关,而BMP7、SLC3A2、VIRMA和PLCE1的表达与患者生存预后不具有统计学差异。(5)酶联免疫吸附法(ELISA)显示,血清中BMP7在ESCC中的水平低于正常对照组,差异具有统计学意义(P=0.043);PLCE1在ESCC中的水平高于正常对照组,差异具有统计学意义(P=0.008);而SLC3A2在ESCC中的水平与正常对照组间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。血清中BMP7和PLCE1的水平有助于ESCC的诊断,ROC曲线下面积分别为0.661和0.749,敏感性为68.0%和63.0%,特异性为65.5%和99.3%。(6)进一步验证YTHDF2的生物学功能发现,在食管癌细胞系中,敲低YTHDF2后细胞的增殖、迁移能力明显降低,细胞周期停滞在S期。结论:(1)ctDNA甲基化差异基因BMP7、YTHDF2、SLC3A2、VIRMA和PLCE1在启动子区甲基化水平、蛋白表达水平或血清水平对ESCC的诊断具有较高的敏感性和特异性。(2)YTHDF2的高表达是食管鳞状细胞癌患者预后不良的指标,且敲低YTHDF2可以抑制食管癌细胞的增殖、迁移,影响细胞周期。