【摘 要】
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目的:探究血管肉瘤干细胞样细胞（Sphere细胞）外泌体来源的HSP90α可以通过抑制血管肉瘤细胞（ISOHAS细胞）自噬促进肿瘤进展的机制研究,明确HSP90α影响ISOHAS细胞自噬的分子机制及其对细胞增殖的影响。方法:（1）基于超高速离心法从细胞培养上清液中分离外泌体,透射电镜观察其形态、大小及免疫胶体金标记,以确定HSP90α在外泌体上的定位情况,Western blot检测外泌体标记CD
【基金项目】
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兵团中青年科技创新领军人才计划（2017CB004）；
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目的:探究血管肉瘤干细胞样细胞（Sphere细胞）外泌体来源的HSP90α可以通过抑制血管肉瘤细胞（ISOHAS细胞）自噬促进肿瘤进展的机制研究,明确HSP90α影响ISOHAS细胞自噬的分子机制及其对细胞增殖的影响。方法:（1）基于超高速离心法从细胞培养上清液中分离外泌体,透射电镜观察其形态、大小及免疫胶体金标记,以确定HSP90α在外泌体上的定位情况,Western blot检测外泌体标记CD63、CD81的表达及其携带HSP90α的水平。（2）PKH67分别标记ISOHAS细胞及Sphere细胞来源的外泌体,与ISOHAS细胞孵育后,Cell Mask标记细胞膜,DAPI标记细胞核,荧光倒置显微镜下观察外泌体被ISOHAS细胞的摄取情况;Western blot检测外泌体对ISOHAS细胞HSP90α表达的调节及对自噬相关分子Beclin 1、P62、LC3的影响;MDC染色及AO染色观察自噬囊泡形成情况。（3）Western blot验证在ISOHAS细胞及Sphere细胞中HSP90α的表达及自噬相关分子Beclin 1、P62、LC3的表达是否与外泌体对ISOHAS细胞的影响一致;MDC染色及AO染色观察自噬囊泡形成情况。（4）应用HSP90α过表达质粒与si RNA分别对ISOHAS细胞中的HSP90α进行过表达和沉默,进一步使用Western blot观察干预HSP90α对自噬相关分子Beclin 1、P62、LC3的表达的影响;MDC染色及AO染色观察自噬囊泡形成情况;免疫荧光染色标记LC3B,观察阻断自噬流后,干预HSP90α表达对自噬流的影响。（5）借助String数据库筛选与HSP90α具有较高可信度的相互作用蛋白,免疫共沉淀验证HSP90α与互作蛋白是否存在蛋白水平结合;使用Western blot验证干预HSP90α表达后PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活状态。（6）应用CCK8检测HSP90α对ISOHAS细胞增殖活力的影响;进一步使用自噬诱导剂RAPA、自噬抑制剂3-MA评估自噬对ISOHAS细胞增殖活力的影响。结果:（1）外泌体来源的HSP90α定位于外泌体表面,ISOHAS细胞及Sphere细胞来源的外泌体与ISOHAS细胞孵育后均能被ISOHAS细胞摄取,进而上调ISOHAS中HSP90α、Beclin 1、P62的表达（P＜0.05）,降低LC3II/LC3I的比值（P＜0.001）;相较于ISOHAS细胞来源的外泌体,Sphere细胞来源的外泌体对于HSP90α、Beclin 1、P62的上调作用以及对LC3II/LC3I的比值的下调作用更为显著（P＜0.001）;MDC、AO荧光染色结果提示外泌体处理后自噬小体数量减少。（2）相较于ISOHAS细胞,在Sphere细胞中HSP90α、Beclin 1、P62呈高表达（P＜0.001）,LC3II/LC3I的比值低于ISOHAS细胞（P＜0.01）。（3）过表达HSP90α可促进Beclin 1、P62的表达（P＜0.001）,降低LC3II/LC3I的比值（P＜0.01）;MDC、AO荧光染色及LC3B免疫荧光染色结果提示过表达HSP90α后自噬小体数量减少,自噬流减弱。（4）抑制HSP90α的表达,可抑制Beclin 1（P＜0.01）、P62（P＜0.001）的表达,升高LC3II/LC3I的比值（P＜0.01）;MDC、AO荧光染色及LC3B免疫荧光染色结果提示沉默HSP90α后自噬小体数量增多,自噬流增强。（5）String数据库筛选出与HSP90α具有高可信度（Score值=0.999）的相互作用蛋白,并确定了AKT1可能与HSP90α相互作用参与mTOR信号通路作用而影响自噬过程;免疫共沉淀验证HSP90α与AKT具有直接结合作用,过表达HSP90α后,PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达上调（P＜0.001）,沉默HSP90α后,PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达下调（P＜0.001）,提示HSP90α可能通过与Akt结合激活mTOR信号通路抑制自噬。（6）过表达HSP90α显著促进ISOHAS细胞增殖（P＜0.01）,反之,沉默HSP90α显著抑制ISOHAS细胞增殖（P＜0.01）;RAPA在一定浓度范围（10n M～100n M）内诱导自噬后抑制ISOHAS细胞增殖（P＜0.05）,3-MA在一定浓度范围内（10～50μM）抑制自噬后促进ISOHAS细胞增殖（P＜0.05）,过量3-MA（100μM）抑制ISOHAS细胞增殖（P＜0.05）。结论:（1）血管肉瘤干细胞样细胞来源外泌体通过上调血管肉瘤细胞内HSP90α表达抑制细胞自噬促进肉瘤细胞增殖（2）HSP90α可能通过与Akt结合进而激活mTOR信号通路抑制自噬,促进血管肉瘤细胞增殖。
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