论文部分内容阅读
啤酒中污染菌是啤酒生产中不可避免的一种生物污染。准确、快速地检测和鉴定出啤酒中的污染菌不仅能保证啤酒品质,还体现出啤酒企业所具有的高技术水平。随着现代生物技术的发展,污染菌的检测方法也日新月异,现在已经成熟应用的有选择性培养基和5种检测和鉴定方法,它们分别是ATP法、抗原抗体免疫法、PCR扩增法、原位杂交法和D-乳酸脱氢酶的电泳谱图法。本研究的主要内容是使用选择性培养基分离纯化出10种污染菌,根据细菌形态把它们分别编号为Ls、Lm、Ll、Lsuper、Lw、P、4—1、5221、5222、928,利用API50CHL鉴定试剂条把它们分别定义为植物乳杆菌、乳酸菌乳球菌乳亚种、短乳杆菌3、短乳杆菌3、短乳杆菌1、短乳杆菌1、植物乳杆菌2、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、德氏乳杆菌德亚种、不可判定菌种。为了更准确地鉴定上述细菌,本研究使用了参考引物“27F-907R”作为测序引物,经过实验证明该引物所产生的PCR扩增结果条带单一、清晰明亮。经过测序和网上BLAST软件比对确定Ls属于Lactobacillus plantarum,4-1和5221属于Lactobacillus parabuchneri,Lm、Lw、P和5222属于Lactobacillus perolens,928属于C.beijerinckii,Ll的比对结果则是属于“Uncultured bacterium clone rRNA228 16S ribosomal RNAgene”即不能确定具体的种。但是根据API50CHL的鉴定结果和参考的与自己设计的短乳杆菌特异性引物经过PCR鉴定为短乳杆菌,故确定Ll为Lactobacillus brevis。根据测序的结果设计出三套种鉴定引物,他们分别是Lactobacillus brevis、Lactobacillu parabuchneri和Lactobacillus perolens鉴定引物,然后通过条件优化确定最佳的退火温度和退火时间,它们分别为45℃1min、55℃2min和56℃2min。外加参考的Lactobacillus brevis和Lactobacillus plantarum种特异性引物组成一个种鉴定引物系列。对经过鉴定的污染菌进行抗啤酒花性和啤酒污染性鉴定,经过实验确定Ls、Lm、Ll、Lw、P、4—1、5221、5222、928最大的抗啤酒花浓度依次为L1>928>Lw>5221>Lm、4-1>Ls、P>5222,同时啤酒污染能力的大小顺序依次为Ll、Lw>5221>P>Ls、Lm>5222>4-1。用啤酒花对污染菌进行驯化,最大的驯化浓度大小依次为Ll、Lw>P>Lm>5221、928>4-1、Ls>5222,显然经过驯化后抗啤酒花能力出现了比较大的变化,特别是Lw、P的抗啤酒花性有很大的提高。通过对抗啤酒花基因horA、horB和horC扩增确定了抗啤酒花基因的拷贝数多少依次为Ll、Lw、P、5221>4-1、Ls>5222、Lm,这与最大驯化浓度大小顺序和啤酒污染浓度大小顺序相吻合。最后通过实验确定啤酒花的驯化浓度和horA的拷贝数呈正相关。最后确定horA改良引物的最低检测浓度为21个/mL。