[目的]　　 乳腺生物反应器具有巨大的市场前景,目前制约其产业化发展的主要原因之一是对乳腺基因表达调控机制认识不足和缺乏可在乳腺高效、特异表达的载体。本研究以湛江地区饲养的荷斯坦奶牛基因组DNA(gDNA)为模板,首先克隆出β-酪蛋白5’-端的不同调控区序列和3’-端调控区序列,然后采用重叠PCR技术将这些不同的调控区片段拼接,构建出分别剔除掉5’-端调控区内的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转座子序列等片段的6种重组p.酪蛋白启动子,并对这一系列重组启动子的活性进行检测,从中筛选出活性最强的重组β-酪蛋白启动子,用于进一步构建高效奶牛乳腺定位表达载体,为开展奶牛乳腺生物反应器的研究工作奠定基础。　　 [方法]　　 根据GenBankX14711提供的奶牛β-酪蛋白基因序列设计引物,以荷斯坦奶牛全血中提取、纯化的gDNA为模板,通过PCR扩增获取奶牛β-酪蛋白基因5’-端及3’-端调控序列;设计12对重叠PCR引物,以5’-端调控序列为模板扩增出分别剔除掉5’-端调控区内的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转座子序列等片段的6对β-酪蛋白基因5’-端调控区上下游调控片段,采用重叠PCR技术将这6对上下游调控片段两两拼接得到6种结构不同的重组β-酪蛋白启动子,并将它们分别定向克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,获得6种含不同重组β-酪蛋白启动子的重组载体;采用脂质体技术将这些重组载体分别转染至乳腺癌细胞MCF-7,通过原代乳腺细胞表达和双荧光素酶检测系统检测这些不同结构的重组β-酪蛋白启动子在乳腺癌细胞MCF-7中引导荧光素酶表达的效能。　　 [结果]　　 PCR电泳和测序鉴定结果表明,采用重叠PCR拼接技术成功构建出了分别剔除掉5’-端调控区内所含的负调控序列、负调控序列和转座子序列重叠区、转座子序列等片段而具有不同序列结构的6种重组β-酪蛋白启动子rp-1、rp-2、rp-3、rp-4、rp-5和rp-6,并成功将它们分别克隆至pGL3-Basic载体中而获得了7种含荧光素酶报告基因和不同结构的重组β-酪蛋白启动子的重组载体pGL3-rp-1、pGL3-rp-2、pGL3-rp-3、pGL3-rp-4、pGL3-rp-5、pGL3-rp-6和pGL3-op-0。　　 双荧光素酶报告系统分析测定结果显示,与天然的奶牛β-酪蛋白启动子op-0相比,重组β-酪蛋白启动子rp-1、rp-2、rp-3、rp-4、rp-5、rp-6和op-0引导荧光素酶表达的活性百分比分别为88.89、48.61、258.33、143.06、647.22、277.78;重组启动子rp-5的表达效能最高。　　 通过插入SV40增强子的方法对表达效能最高的重组启动子rp-5的结构作进一步的改造,获得了预期表达效能更高的重组β-酪蛋白启动子rp-5S和相应的重组载体pGL3-rp-5S。　　 [结论]　　 成功构建了6种结构不同的重组奶牛β-酪蛋白启动子,其中重组β-酪蛋白启动子rp-5的活性最高,其引导荧光素酶表达的活性是原始β-酪蛋白启动子op-0活性的647％。成功将SV40增强子插入启动子rp-5获得了预期表达效能更高的重组β-酪蛋白启动子rp-5S和相应的重组载体pGL3-rp-5S。