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目的:心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是一种“老年病”,其发病率随着年龄的增长而增加。纤维化是多种心血管疾病的共同病理过程,包括心房颤动,而衰老可参与纤维化的发生。既往研究显示辅转录激活因子p300在衰老和纤维化的病理过程中均起重要作用,因此本课题拟验证p300/p53/Smad3通路是否参与心房成纤维细胞衰老,进而导致心房衰老相关的心房纤维化,最终在AF的发生发展中起重要作用。探讨衰老在房颤病理发生过程中的潜在机制,为临床房颤的防治提供新的靶点及实验依据。方法:(1)收集不同年龄组(年轻组:18-49岁;年老组:≥50岁)的AF和窦性心律(Sinus rhythm,SR)患者的心房组织,运用Masson三原色染色和Western Blot实验方法检测各组的心房组织纤维化程度,p300和衰老相关信号通路p53/p21的蛋白表达,纤维化相关指标和信号通路III型和I型胶原蛋白(COL3A1/COL1A1)、基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)、转化生长因子β1(TGF-β1)和Smad3/p-Smad3蛋白水平的表达变化。(2)建立自然衰老小鼠动物模型,Masson染色和Western Blot分别检测各月龄组小鼠心房组织的纤维化,p300和衰老相关信号通路p53/p21蛋白表达,以及纤维化相关指标和信号通路COL3A1/COL1A1、MMP-2/9、TGF-β1和Smad3/p-Smad3蛋白表达水平,验证p300/p53/Smad3与衰老和纤维化的相关性。经颈静脉在体电生理刺激技术检测不同月龄组小鼠电生理参数及AF诱发率,评估老龄小鼠AF易感性变化。(3)原代分离、鉴定小鼠心房成纤维细胞,传代建立复制性衰老模型,衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色及衰老信号通路蛋白p53/p21检测验证模型建立成功;检测不同代数细胞纤维化相关蛋白COL3A1/COL1A1、MMP-2/9、TGF-β1和p300/p53/Smad3的蛋白表达变化。(4)运用p300 si RNA转染技术下调高代数心房成纤维细胞p300蛋白表达、SAM双载体慢病毒感染技术过表达低代数心房成纤维细胞p300蛋白,验证p300参与心房成纤维细胞衰老及纤维化相关蛋白表达。(5)高代数心房成纤维细胞p53 si RNA转染,细胞双荧光共定位和免疫共沉淀实验检测p53/Smad3共定位及蛋白复合物,探讨p53对Smad3的调控机制。结果:(1)与SR患者相比,老龄AF患者心房组织纤维化更明显,p300,衰老信号通路蛋白p53/p21,以及纤维化相关蛋白COL3A1/COL1A1、MMP-2/9、TGF-b1、Smad3/p-Smad3表达增加;提示p300/p53/Smad3与衰老及纤维化相关。(2)自然衰老小鼠模型中,13月龄或18月龄小鼠心房组织纤维化程度增加,且纤维化及衰老相关蛋白表达增加,伴随着p300蛋白表达上调。此外,老龄组小鼠P波时限(PDW)、PR间期、窦房结恢复时间(SNRT)和校正的窦房结恢复时间(CSNRT)延长、心房有效不应期(AERP)60ms缩短,AF诱发率增加。(3)随着小鼠心房成纤维细胞传代代数增加,SA-β-gal染色显示细胞衰老率增加,同时p300、衰老指标p53和p21蛋白、COL1A1、MMP2、TGF-β1和Smad3/p-Smad3等表达明显增加。高代数心房成纤维细胞敲低p300后,衰老信号通路蛋白p53/p21表达减少、Smad3/p-Smad3蛋白及其它纤维化相关蛋白表达减少;而低代数细胞过表达p300则可上调p53、Smad3/p-Smad3及其它纤维化相关蛋白表达。(4)高代数心房成纤维细胞下表达p53,可使p21蛋白下调,纤维化相关蛋白表达减少,但Smad3/p-Smad3减少不明显;而对细胞双荧光共定位检测发现p53、Smad3存在共定位,心房组织蛋白免疫共沉淀实验证明p53和Smad3可形成蛋白复合物。结论:随着年龄增加,心房成纤维细胞中的p300蛋白表达增加,上调p53,激活p21和Smad3,且p53与Smad3结合形成蛋白复合物,通过上调衰老及纤维化相关蛋白表达,参与心房衰老及衰老相关纤维化,最终导致AF的发生。