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随着PCR技术在医学诊断、分子生物学、农业、环保等领域应用的日趋广泛,Taq DNA聚合酶的用量正逐年增加。最初Taq DNA聚合酶是从一种水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)中分离而得,由于原始菌株培养困难,从细菌培养物纯化酶的方法也很繁琐,需要进行选择性沉淀和离子交换色谱分离,并且Taq DNA聚合酶的产量也不高。现在市售的Taq DNA聚合酶大多是基因工程产品。利用基因工程菌菌株生产Taq DNA聚合酶,不但可以解决原始菌株产量低的问题,而且可以通过简化纯化步骤,缩短生产工艺流程,实现Taq DNA聚合酶的商品化生产,从而进一步降低PCR技术的成本,有利于PCR技术更广泛的应用。 虽然Taq DNA聚合酶已经商品化生产多年,制备方法较多,但是目前一些方法生产的酶制剂比活性不高,而一些方法又过于繁琐,增加生产成本。为提高酶蛋白在大肠杆菌中的表达量及酶活性,简化纯化工艺,相关制备技术一直不断地在优化提高。 本实验中供试的Taq DNA聚合酶,分子量为94kDa,由832个氨基酸残基组成,热稳定性好,在75～80℃条件下每个酶分子每秒钟可聚合约150个核苷酸,是目前聚合酶链式反应(PCR)中最为常用的聚合酶。本研究将含有Taq DNA聚合酶基因的pTrc99A质粒转化E.coli菌株,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,从工程菌菌株、转化方法、诱导表达时间、诱导物异丙基硫代-β-D半乳糖苷的浓度和硫酸铵用量5个方面,对Taq DNA聚合酶的制备技术进行优化筛选,提高酶制剂的比活性。SDS-PAGE电泳和PCR扩增结果表明,用E.coliJM109菌株、电击法转化和1.0mmol/L IPTG诱导12h的处理,是本研究筛选出的优化技术组合。此技术组合生产的酶蛋白的表达量、酶活性和比活性,均显著高于其他浓度和时间的处理。Taq DNA聚合酶制剂的纯度、酶活力、敏感性和特异性均达到分子生物学实验的要求,比活性可达2651U/mg,与同类产品相比有较强的优势。