急性肾功能衰竭是多种不同原因引起的肾功能急剧下降的综合征。在临床实践中，由于摄入有毒的物质或一些肾毒性药物引起的急性肾小管损伤是导致急性肾功能衰竭(ARF)的常见原因。虽然许多药物和生长因子已被证实对某些动物的ARF有效，但是近几十年来，并没有明显有效的新治疗方法在临床上应用。 对成体干细胞的研究是近几年的热点，这类细胞具有多向分化潜能。研究发现成体骨髓干细胞(BMSC)不仅能分化为造血细胞，也能分化为多种非造血组织的细胞类型。骨髓内的干细胞包括两种：造血干细胞(HSCs)和间质干细胞(MSCs)。多项研究表明，HSCs和MSCs均具有多向分化潜能。其中，MSCs由于具有易于获取、体外增殖能力强且性能稳定、低免疫原性等特点，使其在再生医学的应用中具有突出的优势。 本实验利用骨髓移植和肾脏移植两种模型，观察骨髓中的干细胞和循环中的干细胞，在正常肾脏组织中，有无参与肾小管上皮细胞的更新、再生，进而为成体骨髓干细胞在肾脏疾病中的应用奠定基础。鉴于MSCs的临床应用潜能，我们观察了MSCs对氯化汞导致的大鼠急性肾小管损伤有无治疗作用，并探讨了其肾脏保护作用的可能机制。 第一章成体骨髓干细胞在肾小管上皮细胞再生中的作用 一、材料和方法 1．骨髓移植模型 选用18只体重200g左右雄性F344大白鼠，水合氯醛麻醉后，取其双侧股骨、胫骨，将骨的两端剪开，用5ml注射器吸取2ml生理盐水，反复几次冲出骨髓腔中的细胞，细胞接着通过200目的钢丝网，制成单细胞悬液，计数，每只雌鼠大约移植5×10<7>个骨髓有核细胞，悬浮于0.5ml的生理盐水中，尾静脉注入全身经C060-γ射线lOGray致死性照射的雌性大鼠中。在照射后6小时内注入骨髓细胞。2周(n=6)、8周(n=6)、14周(n=6)取肾脏标本。 2．肾脏移植模型 另选28只200—250g的F344大白鼠，雌雄各半。将雌鼠的左肾原位移植给雄鼠。2周(n=4)、8周(n=4)、14周(n=6)取移植肾脏标本。 3.HE染色和激光显微切割 肾脏石蜡组织块切成8μM厚切片，捞片于裱有膜的切片上，进行常规HE染色。激光显微切割在20×物镜下，选择肾小管上皮细胞切割，切割下来的细胞在重力作用下落至下方的0.2ml离心管盖内，每个标本大约有2～3×10<4>个细胞被切下。 4.DNA的提取和PCR反应 提取激光切割下来的细胞的DNA，用PCR方法检测细胞中有无Sry基因。 二、结果 1．DNA的提取 从激光切割下的细胞中提取的DNA的浓度大约是10—30μg／ml，吸光度260／280nm>1.80，体积大约为20-30μl。 2．Sry基因的检测 在两种模型8周、14周所取标本中，大部分可扩增出Sry基因特异性的条带：而两种模型2周的标本均未见Sry基因的存在。 三、小结 1．成体骨髓干细胞可能是肾小管上皮细胞再生的一个来源。 第二章骨髓间质干细胞对肾小管损伤的修复作用 一、材料和方法 1．骨髓MSCs的原代培养及诱导分化 取Fischer 344雄性大鼠，6～8周龄，颈椎脱臼处死后，取骨髓细胞过程同前。用含10％胎牛血清的L-DMEM培养基悬浮骨髓细胞，继而接种于25cm<2>的塑料培养瓶中，密度为每瓶2×10<7>个细胞，3天后更换培养液，贴壁细胞即为MSCs。待MSCs传至第五代以后时，分别用成骨和成脂细胞诱导液诱导MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化，以确定它们的多向分化潜能。 2．急性肾衰竭模型的建立及动物分组 大鼠急性肾衰竭模型的建立采用腹腔注射HgCl<,2>的方法，剂量为2mg／kg。SD雌性大鼠分为3组：MSCs组(HgCl<,2>／MSCs)，n=10，腹腔注射HgCl<,2> 4～6小时后，每只大鼠约输注4×10<6>个干细胞；Saline组(HgCl<,2>／Saline)，n=10，使用无菌生理盐水代替治疗组的MSCs。另取3只正常雌性大鼠作为正常对照组。细胞及生理盐水均通过尾静脉输注。7天后，取材进行分析。 3．组织学和肾脏病理损害的评分 肾组织石蜡切片2 μm厚，行HE和PAS染色。对肾小管损害程度采用百分比评分法进行评估，计算20个显微镜高倍视野(×400，HPF)肾皮质及外髓中发生损害(肾小管扩张、萎缩、管型、细胞脱落、坏死或小管炎)的肾小管数目和总肾小管数，以发生损害的肾小管数占总肾小管数的百分比表示，最后取20个视野的平均值作为每个标本最终的肾小管损害评分。 4．免疫组织化学染色和半定量分析 肾组织石蜡切片行免疫组化染色。增殖细胞核抗原(PCNA)用小鼠抗人PCNA-抗体(与大鼠存在交叉反应)标记。每个标本分别计算肾皮质区及外髓区20个高倍视野，进行PCNA<+>细胞的计数，求和后分别取其平均值作为最后数值。 5．统计学分析 组间均数比较采用单因素方差分析，计数资料采用卡方检验，p(0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1.MSCs向脂肪细胞和成骨细胞的分化 采用贴壁法分离的MSCs，是一个异质性群体，体外增殖能力强。MSCs用成脂诱导液诱导下，可见到明显的含有大量脂滴的脂肪细胞形成，经苏丹Ⅲ染色，脂滴被染成桔红色。在用成骨诱导液诱导时，可见大量的钙结节形成，经茜素红染色，含钙的结节被染成桔红色。 2.MSCs治疗改善ARF大鼠的生存状况 腹腔注射HgCl<,2>后，大鼠的死亡主要集中在第5～7天。7天时，MSCs组的生存率明显高于Saline组。在体重改变上，MSCs组略有增加，Saline组则明显下降。 3．MSCs治疗改善ARF大鼠的肾功能 肾功能的检测结果显示，MSCs组的Scr、BUN均明显低于Saline组，但Scr仍高于正常大鼠。 3．MSCs治疗促进肾小管上皮细胞损伤的修复 7天时，Saline组的皮质和外髓质许多小管仍可见到扩张、管型、细胞肿胀、炎症细胞浸润等病变的存在，而MSCs组则明显减轻。 4．肾小管上皮细胞PCNA表达情况 PCNA是增生细胞核抗原，肾小管损伤时PCNA表达增多，随着肾功能的恢复，PCNA<+>细胞数会逐渐减少。HgCl<,2>致急性肾小管损伤后7天，Saline组PCNA<+>细胞数显著高于MSCs组。@2三、小结 1．MSCs输注可改善HgCl<,2>导致的急性肾衰竭大鼠的生存状况及肾功能； 2．MSCs输注可促进肾小管上皮细胞损伤的修复。 第三章骨髓间质干细胞促进肾小管损伤修复的机制 一、材料和方法 1．EGFP质粒稳定转染MSCs 为了追踪注入大鼠体内的MSCs，我们用pEGFP质粒转染MSCs以作为标记。转染后72小时，在培养基中加入G418 lmg/ml进行筛选。然后挑选表达GFP强的MSCs克隆进行扩增，用于移植。 2．免疫组织化学染色和半定量分析 肾组织石蜡切片行免疫组化染色。巨噬细胞用消鼠抗大鼠CD68单克隆抗体(ED-1)标记。每个标本分别计算肾皮质区及外髓区20个高倍视野(×400)，进行EDl<+>细胞的计数，求和后分别取其平均值作为最后数值。 3．RT-PCR 从新鲜冰冻组织中提取RNA，用RT-PCR的方法检测TNF-a、IL-1β、MCP-1、EGF、HGF、PDGF，以GAPDH作为内参照，计算与内参照比值，以作为最终的数值。 4．统计学分析 组间均数比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。 二、结果 l.MSCs在肾脏的分布 7天时，在MSCs移植组大鼠的肾组织中，仅在肾间质偶尔可见GFP染色阳性的细胞，而在肾小球和肾小管处并没有检测到。 2．肾间质巨噬细胞浸润的情况 ED-1是巨噬细胞的标志物，正常肾组织中巨噬细胞很少。急性肾功能衰竭时，浸润的巨噬细胞增加，主要集中在肾小管间质损害显著处。7天时，Saline组ED-1<+>细胞数显著高于MSCs组。 3．肾组织中细胞因子的表达情况 急性肾小管损伤时，一些生长因子可以促进小管上皮细胞的修复，而一些炎症因子的释放则不利于细胞的修复。7天时，EGF、PDGF、HGF在MSCs组肾组织中的表达均明显高于Saline组；促炎症因子中，MSCs组的TNF-a明显低于Saline组，而IL-1β和MCP-1虽比Saline组低，但差异无统计学意义。 结论 本研究发现成体骨髓干细胞可能是肾小管上皮细胞再生的一个来源。MSCs输注可改善HgCl<,2>导致的急性肾衰竭大鼠的生存状况及肾功能，并促进肾小管上皮细胞损伤的修复。短期内，MSCs促进小管细胞的修复，可能是通过减轻炎症反应，调节肾组织微环境中细胞因子的分泌起作用的，并不是或不主要是通过自身转分化成受损的细胞而起作用。