近些年,癌症已成为世界上人类死亡的主要原因之一。据统计显示,90%的癌症相关的死亡是由癌症转移引起的。因此,早诊断、早治疗、实时监测、预防癌症病灶转移是增加癌症患者存活率的关键。生物标志物对诸如癌症和心脏病等主要疾病的早期诊断十分重要。目前,临床中最常用的与癌症相关的生物标志物是蛋白质/抗原。例如,前列腺特异性抗原(PSA),甲胎蛋白(AFP),癌胚抗原(CEA)等。外泌体是另一类强大的生物标志物,正在迅速引起人们的关注,被认为是医学中生物标志物的未来。外泌体是通过内溶酶体途径从多囊泡体释放到细胞外基质的盘状囊泡(30-150 nm)。外泌体携带来自其亲代细胞大量的遗传信息,包括跨膜和胞质蛋白,mRNA,DNA和microRNA。因此,它们充当信使,其指示和变化与疾病相关,特别是在癌症相关的生理病理的状态改变中具有重要作用。且几乎所有细胞类型都能分泌外泌体,可以进入各种体液,包括血液,尿液,母乳,胆汁,腹水,眼泪和唾液等,具有高稳定性。特别是,根据近期报道癌症患者体内循环中的外泌体浓度明显升高。因此,外泌体现如今已被公认为是可用于早期癌症诊断的有前景的生物标志物。目前,尽管有许多关于外泌体纯化检测的研究报道,但外泌体的定量仍然具有挑战性。传统的外泌体定量分析方法包括(1)流式细胞仪,可提供高通量的检测但由于光散射较弱,往往会错过小囊泡(<200 nm);(2)纳米粒子追踪分析(NTA)或(3)动态光散射(DLS)的新计数方法,可以提供更准确的粒子计数,比那些通过流式细胞术检测的报道高出10~3倍,但检测浓度范围有限;(4)蛋白印迹和(5)酶联免疫分析等常规分子测定需要大量样品,这无法广泛的应用于临床研究和检测中,特别是连续分析大型患者群组或生物储存库中的有限样本。因此,在常规临床环境中分析检测外泌体仍然是一项困难的任务,主要是由于缺乏足够敏感和快速的测定平台。现如今,价格低廉、简单便携的生物传感检测技术发展迅速。纳米通道生物传感器是近年来发展起来的一种新型生物传感器,其物理结构稳定、表面易于进行化学修饰、测量结果简单快速并且具有高灵敏度。其原理为纳米通道内壁被功能分子修饰,该功能分子具有靶标的识别位点。功能探针和靶标之间的结合会引起有效孔径,内表面电荷和内壁润湿性的变化,从而导致离子电流的变化。因此,通过测量在添加靶标之前和之后的电流-电压(I-V)曲线,可以实现目标的检测。纳米通道传感平台为纳米尺度的功能分子和分析物之间的相互作用提供了一个固定的三维环境,这在纳米通道中快速频繁地产生了传输反应物的动力学效应。这些特点使得纳米通道生物传感器的检测简单快速且具有高灵敏度,广泛用于临床医学和卫生环境样本的各种指标的传感检测。其应用范围包括气体、各种蛋白分子、核酸分子、细胞等。基于此研究背景,本论文构建了一种双抗体功能化的纳米通道生物传感器,并将其应用于外泌体的高灵敏、快速检测。工作主要分为以下两个部分:第一部分:双抗体功能化的纳米通道生物传感器的构建在这项工作中,我们选择了多孔阳极氧化铝膜(PAA)作为基底来构建该传感装置。首先我们将PAA膜进行酸化处理使其通道表面大量羟基活化;随后将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛(GA)依次修饰到纳米通道表面,最后通过希夫反应将双抗体(CD63抗体和EpCAM抗体)修饰固定在在通道表面。为了验证该传感器成功的构建,开展了一系列表征实验,例如,电学测试、接触角(CA)和X射线光电子能谱(XPS)分析以及荧光抗体实验。以上表征实验结果均表明APTES、GA和双抗体已经成功地修饰在纳米通道外表面并且结构稳定。构建的双抗体功能化的纳米通道生物传感器可应用于下一步的外泌体检测。第二部分:基于双抗体功能化的纳米通道生物传感器超灵敏检测外泌体在本阶段的工作中,我们将之前构建的双抗体功能化的纳米通道传感器应用于外泌体的高灵敏、快速检测。首先,通过外泌体膜表面携带的抗原和抗体的识别选择性地将外泌体捕获在纳米通道表面。由于外泌体的颗粒大小远大于纳米通道的孔径,外泌体将会覆盖在纳米通道膜表面,无法进入纳米通道内部。然后,通过记录I-V曲线可以监测整个过程,以实现外泌体准确,灵敏的检测。我们通过透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和蛋白质印迹(WB)等表征实验结果表明外泌体从细胞培养上清液中成功提取。并且电学实验和扫描电子显微镜(SEM)结果证明了外泌体被成功的捕获在纳米通道表面。与单个抗体检测相比,双抗体功能化的纳米通道传感器其检测效率提高了近两倍。使用这种方法可以有效地检测到浓度范围为3.3×10~4至3.3×10~9颗粒/mL的外泌体,其检测限低至7.3×10~3颗粒/mL。最后,我们检测分析了从5例肝癌患者,13例肺癌患者和10例健康个体血浆中提取的外泌体以证明该方法的临床应用能力。结果表明,癌症患者血浆中的外泌体含量普遍要高于健康个体,该方法有望应用于临床癌症的早期筛查。