研究目的：椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease, DDD)是骨科常见病,主要包括退行性脊柱侧弯、椎间盘突出及椎管狭窄等,是引起腰背痛的主要原因。70岁以上的人群中,60%具有严重椎间盘退变,临床上超过90%的脊柱外科疾病都与椎间盘退变有关。早期治疗主要是止痛对症等保守治疗,后期多采用手术治疗,而手术治疗可导致相邻节段椎间盘退变等并发症,长期疗效不好,并且不能阻止椎间盘退变进展,也不能使椎间盘恢复正常的生理功能。近年来,许多研究者探索各种生物学治疗方法,以再生修复退变椎间盘,恢复椎间盘生物学功能。退变椎间盘内细胞数量减少,分泌细胞外基质能力降低,细胞外基质如蛋白多糖含量减少,通过生物学方法提高椎间盘内细胞数量,增强髓核细胞分泌细胞外基质的能力,改善细胞外基质成分,理论上能够修复退变的椎间盘。生物学治疗方法主要有细胞因子注射、基因治疗、细胞移植及组织工程技术等。细胞因子注射入体内易降解,半衰期短,基因治疗存在一定安全隐患,组织工程技术需要种子细胞、支架材料及生物因子有效复合,影响因素多,技术难度大；而细胞移植治疗椎间盘退变已经取得重大进展,已经由实验研究转化为临床应用研究。利用患者自体骨髓间充质干细胞移植治疗DDD,取得了良好的效果,证实间充质干细胞移植的有效性和安全性。DDD多发生于老龄患者,体内间充质干细胞活性下降,增殖能力低,并且获取具有创伤性,因此探索新来源的间充质干细胞治疗DDD具有重大的研究意义及临床应用前景。近年来,一种脐带来源的华通胶间充质干细胞(Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, WJMSCs)逐渐受到重视。WJMSCs增殖分化能力强,能分化为多种组织细胞,如骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞和肌腱细胞等。相比成人间充质干细胞,来源丰富,获取无创伤性,免疫源性更低,是理想的种子细胞来源。本人前期已经成功提取鉴定WJMSCs,并通过细胞共培养的方法将其诱导分化为类髓核细胞。本课题的研究目的是在前期研究的基础上,通过动物实验,探索人华通胶间充质干细胞移植修复退变椎间盘的潜能,为临床应用细胞移植技术治疗DDD提供更理想的种子细胞库。研究方法：本课题通过酶消化法提取脐带华通胶间充质干细胞,利用流式细胞仪检测细胞免疫表型CD90、CD73、CD105、CD29、HAL-ABC、CD34、CD45和HLA-DR;使用rAAV2-EGFP体外感染标记WJMSCs,不同感染复数感染细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,流式细胞仪检测感染效率,CCK-8法检测rAAV2病毒对WJMSCs增殖的影响,确定最佳感染复数值,建立rAAV2-EGFP标记的华通胶间充质干细胞种子细胞库。选用20只比格犬作为实验动物,用穿刺抽吸髓核组织法建立犬椎间盘退变模型(L4-5/L5-6/L6-7),造模术后4周行腰椎正侧位X线平片和核磁共振成像(MRI)检查,处死2只动物行组织学观察。证实退变模型造模成功后,对剩余18只动物模型行华通胶间充质干细胞移植手术。每只犬L3-4椎间盘作为对照组(A组);L4-5椎间盘作为退变组(B组),不进行移植手术操作,L5-6椎间盘作为注射组(C组),进行单纯生理盐水注射,L6-7椎间盘作为移植组(D组),注射含有人脐带华通胶间充质干细胞的生理盐水细胞悬液。细胞移植术后4、8、20周行动物腰椎正侧位X线片检查及腰椎MRI检查,测量椎间盘相对高度指数及髓核相对灰度指数；术后20周处死动物取材,利用生物力学机检测各组脊柱运动节段的运动范围；对髓核组织进行冰冻切片,利用荧光显微镜观察冰冻切片绿色荧光蛋白表达情况;髓核组织普通切片,利用HE染色和番红O染色观察组织形态学变化,利用免疫组织化学染色观察各组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9表达及移植组GFP的表达；提取髓核组织RNA,进行反转录生成cDNA,利用Real-Time PCR方法检测蛋白多糖、Ⅱ型胶原、SOX-9及Ⅰ型胶原基因的相对表达变化。结果：成功提取华通胶间充质干细胞,原代培养呈梭形和多角形贴壁生长,传代后细胞呈梭形形态,增殖速度加快,呈漩涡状排列生长；流式细胞检测其阳性表达CD90/CD73/CD105/CD29/HAL-ABC,阴性表达CD34/CD45/HLA-DR。rAAV2-EGFP的感染率随着感染复数的增加而增加,感染复数为1×104、1×105v.g/cell时,CCK-8法检测结果显示各感染组与对照组A值无统计学差异(P>0.05),感染复数为1×106v.g/cell时,感染组细胞增殖能力降低,与对照组比有统计学差异(P<0.05),获得最佳感染复数为1×105v.g/cell。采用穿刺抽吸髓核组织造模后动物全部存活,造模术后4周X线平片结果显示造模节段椎间盘相对高度指数与对照组对比无差异(P>0.05), MRI检查结果显示造模节段髓核相对灰度指数下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05),造模节段髓核切片HE染色结果显示髓核组织内细胞数量变少,有轻度纤维组织增生,无新生血管及炎性细胞浸润；番红O染色显示髓内蛋白多糖含量降低,提示造模成功。细胞移植术后20周,A组影像学、生物力学、组织学及分子生物学检测均正常,没有退变表现,而B、C、D组均有退变表现。影像学检测结果显示随着观察时间的推移,B、C、D组椎间盘相对高度指数及髓核相对灰度指数逐渐下降,但不同时间点D组椎间盘相对高度指数及髓核相对灰度指数比B组和C组高(P<0.05);生物力学检测D组与B组和C组相比前屈后伸及芹右旋转运动范围有统计学差异(P<0.05)；D组髓核组织冰冻切片荧光显微镜能够观察到绿色荧光蛋白表达；HE染色及番红O染色结果显示D组髓核组织内细胞数量比B组和C组多,组织结构维持好,髓核内蛋白多糖含量高。免疫组织化学染色结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9表达高于B组和C组；Real-Time PCR检测结果显示D组Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX-9基因表达均比B组和C组高(P<0.05)。结论：人脐带华通胶组织含有丰富的间充质干细胞,表达间充质干细胞相关免疫表型,重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定感染华通胶间充质干细胞,在感染复数为1×105v.g/cell时对细胞增殖无明显影响,能为椎间盘细胞移植提供理想的标记细胞。穿刺抽吸髓核组织法能够造成犬椎间盘退变,为细胞移植方法修复退变椎间盘研究建立理想的动物模型。人脐带华通胶间充质干细胞移植入犬退变椎间盘髓核内能够长期存活,能增加髓核内细胞外基质含量及含水量,保持椎间盘高度及生物力学性能,能够有效延缓椎间盘退变的进展。该研究结果证实了人脐带华通胶间充质干细胞体内修复退变椎间盘的潜能,有望为人椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供新的种子细胞。